Metodología del Cytometry de flujo, aplicaciones, y análisis de datos

El cytometry de flujo se utiliza para determinar las propiedades físicas y químicas de células en una población heterogénea. Usando este método, los parámetros múltiples de células se pueden analizar simultáneamente. Este artículo describe los principios de base del cytometry de flujo, es usos y cómo los datos cytometric pueden ser analizados.

Este artículo revestirá:

Imagen de las células y de los anticuerpos que se podrían analizar usando cytometry de flujo.Design_Cells | Shutterstock

Principios de base del cytometry de flujo

Se utiliza el cytometry de flujo cuando hay una necesidad de perfilar un gran número de diversa célula pulsa hacia adentro una población. Las células se separan en base de diferencias de tamaño y morfología. Además, los anticuerpos fluorescente-marcados con etiqueta que apuntan los antígenos específicos en la superficie de la célula se pueden utilizar para determinar y para segregar a diversas subpoblaciones.

Los pasos básicos incluyen el paso de las células a través de un canal estrecho, tal que cada célula es iluminada por un laser uno a la vez. Una serie de sensores entonces descubre la luz refractada o emitida, y estos datos son integrados y compilados para generar la información sobre la muestra.

¿Qué se puede el cytometry de flujo utilizar para medir?

El cytometry de flujo ayuda a analizar varios parámetros de una célula simultáneamente. Algunos de estos parámetros son descritos más abajo:

Análisis funcional

Este método puede determinar actividad biológica dentro de las células, tales como la generación de especie reactiva del oxígeno, de cambios mitocondriales de la membrana durante apoptosis, de regímenes de la fagocitosis en bacterias etiqueta, de contenido nativo del calcio, y de contenido cambiante del metal en la reacción de la reacción a las drogas, al etc.

Determinación de viabilidad de la célula

Este método se puede también utilizar para fijar viabilidad de la célula después de la adición de organismos o de drogas patógenos. Cualquier brecha en integridad de la membrana celular puede ser resuelta usando los tintes que pueden entrar en la membrana celular pinchada. Las antenas fluorescentes tales como bis-oxonol pueden atar a las proteínas presentes en la membrana celular, permitiendo para la identificación de diversos escenarios de la necrosis.

Apoptosis y necrosis de medición

El Apoptosis o la muerte celular programada es acompañado por los cambios característicos en forma de la célula, la baja de estructuras, el destacamento de la célula, la condensación del citoplasma, la contracción de la célula, la fagocitosis de residuos celulares y cambios en el envolvente nuclear.

Algunos de los cambios bioquímicos incluyen proteólisis, la desnaturalización de la DNA, la deshidratación de la célula, la interconexión de la proteína, y una subida en los iones libres del calcio. Estos cambios físicos y bioquímicos se pueden descubrir usando cytometry de flujo.

Oncosis es una acción necrótica donde la célula comienza a hincharse bastante que se encoge. Esto lleva a la ruptura de la membrana de plasma y de la baja de las enzimas proteolíticas que pueden también dañar los tejidos circundantes. Estos cambios en la forma de la membrana y de la célula de plasma se pueden fijar usando cytometry de flujo.

Análisis del ciclo celular

La cantidad de DNA presente en el núcleo varía durante cada fase del ciclo celular. Esta variación en contenido de la DNA se puede fijar usando los tintes fluorescentes que atan a la DNA o a los anticuerpos monoclonales, que pueden permitir la detección de la expresión del antígeno.

Otros factores incluyendo el contenido de los pigmentos de la célula tales como variación del número de la clorofila, de copia de la DNA, antígenos intracelulares, actividad enzimática, explosiones oxidativas, glutatión, y adhesión de la célula se pueden medir semejantemente usando este método.

¿Cómo los cytometers del flujo trabajan?

Fluídica

Durante cytometry de flujo, un líquido de la vaina hidrodinámico enfoca la suspensión de la célula a través de una pequeña boquilla tales que solamente una célula pasa la luz laser al mismo tiempo. Un detector se coloca delante de rayo láser tales que puede capturar la luz dispersa delantera de las células, mientras que varios detectores también se colocan a los lados para medir la cantidad y la intensidad de la luz dispersas en cada dirección.

La dispersión frontal refiere a la luz refractada por una célula que esté viajando en la misma dirección que viajaba originalmente. La proporción de luz que adelante se disperse se correlaciona con la talla de célula, donde partículas más de gran tamaño producen una luz dispersa más delantera.

La dispersión lateral refiere a la luz refractada que es ortogonal a la dirección del camino liviano. La luz dispersa lado ofrece la información sobre la granulosidad, donde las células altamente granulares producen más luz lado-dispersa comparada a las células con granulosidad inferior.

Por ejemplo, mientras que realizan el cytometry de flujo de muestras de sangre, los granulocytes grandes y granulares muestran una alta dispersión delantera y lateral; monocitos que son demostración grande pero no granular una alta dispersión lateral delantera pero más inferior. Así, sobre la base de la proporción de luz que sea tipos dispersos, diversos delanteros y laterales de poblaciones puede ser separado.

Separación basada en la emisión de la fluorescencia

Aparte de la dispersión delantera y lateral, diversos tipos de células se pueden también separar basaron en la luz emitida por las moléculas fluorescentes. Esta fluorescencia puede ser debido a los materiales naturalmente que son fluorescentes dentro de una célula, o a los anticuerpos fluorescencia-marcados con etiqueta. Por ejemplo, el fluorocromo se utiliza para manchar una proteína del interés de modo que la luz laser del incidente de la longitud de onda apropiada permita las células que contienen esta proteína que se descubrirá.

Mientras que una célula pasa con el de rayo láser, un pulso de la emisión del fotón se crea. Este pulso es descubierto por el tubo de fotomultiplicador y convertido a un pulso de voltaje, que se puede interpretar por el cytometer del flujo. Cuanto más alta es la intensidad de la fluorescencia, más alto es el pulso de voltaje.

Interpretación de los datos

Cada célula que pasa a través de la luz laser se descubre como acción separada. También, diversos tipos de luz descubierta: delantero-dispersión, la lado-dispersión, y las longitudes de onda específicas de la emisión de la fluorescencia, se destina un canal distinto. Los datos para cada uno de estas acciones se trazan independientemente y se pueden representar por dos métodos: histogramas y punto-gráficos.

Los histogramas comparan un único parámetro, donde la intensidad se traza en un eje y el número de acciones se traza en un eje separado. los Punto-gráficos pueden comparar más de un parámetro simultáneamente, donde se visualiza cada acción mientras que de la intensidad los valores monopunto y de dos o tres canales se representan en el diverso eje.

En este decorado, las acciones que tienen similar las intensidades se agrupan en el gráfico del punto. Mientras que los punto-gráficos pueden comparar parámetros múltiples juntos, los histogramas son más fáciles de leer y de entender. En muchos casos, los punto-gráficos y los histogramas no están mutuamente - la exclusiva, y en muchos experimentos del cytometry de flujo ambos tipos de gráficos se traza para representar y para fijar datos multi-paramétricos.

El bloquear en cytometry de flujo

El bloquear es un método usado en el cytometry de flujo donde más información cerco preferencial sobre cierta subpoblación de células. Esto agrega la resolución adicional al cytometry de flujo y se puede utilizar para analizar parámetros múltiples.

En un experimento bloqueado del cytometry de flujo, los datos cerco sobre uno o más canales del punto-gráfico. Entonces, una caja de la entrada es exhausta y una subpoblación de células se selecciona para más análisis. Destacan a esta subpoblación en otros gráficos que visualicen la información de los canales alternos. Este método ayuda a ofrecer mayor adaptabilidad y la resolución unicelular para cada canal.

Fuentes

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Last Updated: Jun 28, 2019

Dr. Surat P

Written by

Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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