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Cytometry de fluxo e descoberta da droga

O cytometry de fluxo é um método analítico que permita que as pilhas rapidamente estejam analisadas e categorizadas por lasers enquanto passam na único-lima. A maneira em que o laser é dispersado pode ser usada para pressupr um grau de informação em relação à pilha, tal como o tamanho, a complexidade interna, e a granulosidade da pilha, quando uma identificação mais específica da estrutura puder ser conseguida incorporando fluorophores e a microscopia fluorescente no processo.

Outros métodos da caracterização tais como a espectrometria em massa podem ser incorporados directamente no equipamento do cytometry de fluxo para permitir que uma caracterização mais refinada seja empreendida in situ.

Descoberta da droga

Crédito de imagem: paulista/Shutterstock.com

Cytometry de fluxo na identificação do alvo

O cytometry de fluxo foi utilizado em cada fase do processo de descoberta da droga, da identificação do alvo para conduzir a revelação. Os alvos válidos da droga nas pilhas abrangem quase a pletora inteira de estruturas biomoleculares disponíveis: a membrana de pilha, alguma proteína envolvida na função mecanicista ou na sinalização, ADN para baixo ao nível do gene, e outras moléculas menores tais como o mRNA.

A caracterização de grandes e populações variadas da pilha em uma maneira alta da produção é útil na identificação inicial do alvo, permitindo que as pilhas (doentes) disfuncionais sejam separadas para uma análise mais profunda por outras técnicas. Este processo pode mais ser aperfeiçoado etiquetando características moleculars dentro da pilha suspeitada para ser envolvido na doença com as pontas de prova fluorescentes, e desta maneira, as características estruturais da pilha tais como a abundância de uma proteína particular ou a integridade da membrana de pilha podem rapidamente ser avaliadas.

A identificação de seguimento do alvo e a geração de uma droga conduzem a eficácia e a toxicidade da droga pode ser investigada pelo cytometry de fluxo. É possível pressupr rapidamente estes resultados pela contagem de células da alto-produção, embora as pilhas frequentemente são classificadas então baseadas na fase do apoptosis.

Entre diversos outros métodos que marcam para fora a activação de mecanismos celulares particulares, o apoptosis pode ser monitorado usando o annexin fluoróforo V da proteína, que liga ao phosphatidylserine do phospholipid. Este componente da membrana de pilha vem à superfície da pilha na concentração alta durante as fases iniciais de apoptosis, permitindo as pilhas que experimentam a toxicidade da terapia sob a investigação a ser identificada.

Cytometry de fluxo na revelação do chumbo

Similarmente, as pilhas que submetem-se ao apoptosis atrasado podem ser identificadas por sua estrutura gotejante da membrana, e assim por uma variedade de fluorophores que se esforçam para penetrar a membrana intacto mas a ligação com estruturas de pilha internas tais como o ADN é usada frequentemente marcar para fora estas pilhas. O iodeto de Propidium é uma tal tintura ADN-obrigatória, que pode igualmente ser usada para se diferenciar entre a fase do ciclo que de pilha a pilha é actualmente dentro.

As pilhas nas fases de G2 ou de M têm somente uma cópia do ADN, quando as pilhas que se submetem à cariocinese nas fases G0 ou G1 carregarem duas cópias, e assim a intensidade da fluorescência pode ser usada para calibrar a fase. Uma pausa no ciclo de pilha pode ser indicativa da eficácia ou da toxicidade da droga, segundo se a pilha que está sendo analisada está considerada o alvo da terapia.

O alvo de um composto da droga é frequentemente interromper ou aumentar a ligação a um alvo específico ou entre moléculas específicas, e assim a intensidade da fluorescência detectada da pilha correlaciona bem com as interacções entre o composto etiquetado do interesse e o alvo específico dentro da pilha.

o teste do Largo-espectro in vitro de uma variedade de pilhas sob uma escala das circunstâncias e a análise pelo cytometry de fluxo igualmente ajuda pesquisadores a identificar a situação óptima testa in vivo para ser executado mais tarde, pagando a atenção particular à toxicidade identificando as pilhas que submetem-se à apreensão do ciclo do apoptosis ou de pilha.

Aplicações futuras

O cytometry de fluxo é usado igualmente para estudar a eficácia e a segurança vacinais em um número de capacidades, tais como a quantificação da carga viral, a identificação de anticorpos de IgG e de IgM, e a medida respostas da pilha do t e de b.

Em um exemplo do último argumento, a resposta de célula T de CD4+ e de CD8+ de indivíduos vacinados contra peptides do ponto SARS-CoV-2 foi avaliada em indivíduos vacinados pelo Ewer e outros (2020) que usa o cytometry de fluxo, onde as pilhas foram manchadas em primeiro lugar com um cocktail de anticorpos anti-humanos da proteína da superfície do t-cell e de cytokines anti-humanos.

A presença de proteínas envolvidas na activação de célula T e na secreção de cytokines inflamatórios é evidência da eficácia vacinal, e a natureza da alto-produção do cytometry de fluxo provou altamente benéfico para tais aplicações desde a manifestação da pandemia COVID-19.

Os cytometers modernos do fluxo da parte alta utilizados na indústria farmacêutica são capazes de processar dez dos milhares de por segundo das pilhas em uma maneira inteiramente automatizada, embora quando empreender uns graus mais altos de análise da caracterização é dramàtica mais lento.

Continuamente os bioreactores do corredor geram as pilhas para testar que pode então ser expor a uma variedade de circunstâncias e mais tarde ser pelo cytometry de fluxo, incluído o uso da tubulação especializada que replicates as forças de tesoura encontradas em vasos sanguíneos.

A automatização aumentada, a velocidade de processamento da pilha, e uma variedade de técnicas da caracterização incorporadas directamente no equipamento do cytometry de fluxo serão provavelmente ir observado para a frente. Além de melhorar a eficiência e conseqüentemente a precisão, como um número maior de pilhas pode ser testado e analisado em detalhe, isto igualmente permitirá que uns perfis de segurança mais robustos sejam desenvolvidos para compostos novos, com uma variedade maior de pilhas testadas em circunstâncias relevantes.

Referências:

Further Reading

Last Updated: Nov 12, 2021

Michael Greenwood

Written by

Michael Greenwood

Michael graduated from Manchester Metropolitan University with a B.Sc. in Chemistry in 2014, where he majored in organic, inorganic, physical and analytical chemistry. He is currently completing a Ph.D. on the design and production of gold nanoparticles able to act as multimodal anticancer agents, being both drug delivery platforms and radiation dose enhancers.

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