Citometria a flusso contro microscopia di fluorescenza

La microscopia e la citometria a flusso di fluorescenza sono strumenti di bioanalysis utilizzati per quantificare il numero totale ed il tipo di celle in un campione. Entrambi i metodi hanno uso diffuso ma differiscono leggermente nella loro applicazione.

Campione all

Micha Weber | Shutterstock

Che cosa è microscopia di fluorescenza?

La microscopia è esistito prima di citometria a flusso ed era una parte integrante di suo sviluppo. Un microscopio fluorescente, nei termini semplici, è un microscopio ottico migliorato che usa un indicatore luminoso di più alta intensità per eccitare i fluorophores nell'esemplare.

L'eccitazione dei fluorophores (o delle specie fluorescenti) li spinge per emettere l'indicatore luminoso ad un'energia più bassa con le lunghezze d'onda più lunghe, che produce l'immagine ingrandetta. Si applica solitamente alle caratteristiche specifiche delle cellule. La fluorescenza è raggiunta facendo uso degli anticorpi etichettati con i fluorophores che mirano alle funzionalità specifiche. Tuttavia, macchiare può anche essere molto specifica.

Che cosa è citometria a flusso?

Con citometria a flusso, i beni delle celle possono essere quantificati. Ciò è fatta su base individuale per ogni cella e comprende le misure quali la dimensione delle cellule, la granularità e la quantità di componenti delle cellule (quali DNA, RNA messaggero e proteine intracellulari).

I valori quantitativi derivati con citometria a flusso possono essere sia valori relativi che assoluti, ma sono in genere relativi. La citometria a flusso ampiamente si applica per identificare le celle, celle di conteggio ed individua gli indicatori o i microrganismi sicuri.

Paragone microscopia e della citometria a flusso di fluorescenza

Sia la microscopia che la citometria a flusso di fluorescenza misurano gli importi quantitativi delle componenti cellulari; tuttavia, differiscono negli aspetti di individuazione le componenti cellulari, il volume di celle che possono trattare e del preparato del campione prima dell'analisi.

La microscopia di fluorescenza può mostrare come una componente si distribuisce nella cella - costante o è ragruppata in compartimenti anatomici. Può anche mostrare indipendentemente da fatto che quella concentrazione cambia temporaneamente o rimane statica.

La citometria a flusso non può specificare solitamente dove la componente è posizionata esattamente dentro la cella. Ciò egualmente significa che quando la citometria a flusso quantifica una componente cellulare, la fa ad un livello della intero-cella, mentre la microscopia di fluorescenza può quantificare le componenti all'interno dei compartimenti cellulari.

La microscopia di fluorescenza può quantificare solitamente le componenti cellulari per i dieci o i centinaia di celle. La citometria a flusso, tuttavia, può trattare i più grandi volumi fino di centinaia di migliaia di celle. Ancora, la citometria a flusso può usare le proprietà fluorescenti per distinguere ed ordinare le celle viventi in migliaia, mentre la microscopia di fluorescenza è incapace di questa.

Per preparare i campioni per citometria a flusso, le celle devono essere in una sospensione monodispersed; la microscopia di fluorescenza non richiede questa. Inoltre, la microscopia di fluorescenza può fornire le informazioni sulle interazioni cellulari, che sono rare quando usando la citometria a flusso.

Microscopia e citometria a flusso di fluorescenza in uso

Come citato, mentre la microscopia di fluorescenza e la citometria a flusso raggiungono gli stessi più vasti scopi, presentano i loro propri vantaggi e vantaggi, rendente li adatti a ruoli differenti. Una volta applicate allo stesso campione, tuttavia, possono dare i risultati differenti, come suggerito tramite una certa ricerca studia.

Per esempio, una volta usata per misurare la frammentazione in seme, citometria a flusso del DNA ha indicato le più alte misure di danno degli spermatozoi. Specificamente, la citometria a flusso ha indicato il danno che era 2,6 volte maggior in confronto a microscopia di fluorescenza.

Gli esperti non sono interamente sicuri perché questa differenza è osservata.  Con microscopia di fluorescenza, la soggettività si trasforma in in un'emissione oltre alla lunghezza delle osservazioni, perché le molecole fluorescenti sono candeggiate.

Tuttavia, la citometria a flusso egualmente ha certa portata per la variabilità. Ci sono metodi differenti per stabilire la popolazione di interesse e per stimare quanti eventi sono positivi. Una soglia deve essere collocata per misurare la percentuale delle molecole positive per l'indicatore fluorescente, ma questa soglia può essere collocata facendo uso dei campioni di riferimento differenti e, così, della variabilità di causa fra gli studi.

Ancora, per questo studio specifico, la frammentazione del DNA in celle può essere dura da individuare. Le intensità fluorescenti si distribuiscono dentro quale il modo che sovrappongono il autofluorescence, che è un'emissione di luce naturale dalle strutture quali i mitocondri.

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Last Updated: Nov 20, 2018

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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