Cytometry de fluxo contra a microscopia de fluorescência

A microscopia de fluorescência e o cytometry de fluxo são ferramentas do bioanalysis usadas para determinar o número total e o tipo de pilhas em uma amostra. Ambos os métodos têm uso difundido mas diferem ligeira em sua aplicação.

Amostra dentro do microscópio fluorescente - por Micha Weber

Micha Weber | Shutterstock

Que é microscopia de fluorescência?

A microscopia existiu antes do cytometry de fluxo e foi uma parte integrante de sua revelação. Um microscópio fluorescente, em termos simples, é um fotomicroscópio aumentado que use uma luz de uma intensidade mais alta para excitar fluorophores no espécime.

A excitação dos fluorophores (ou da espécie fluorescente) alerta-os para emitir-se a luz em uma energia mais baixa com comprimentos de onda mais longos, que produza a imagem ampliada. É aplicada geralmente às características específicas da pilha. A fluorescência é conseguida usando os anticorpos etiquetados com os fluorophores que visam características específicas. Contudo, manchar pode igualmente ser distante menos específica.

Que é cytometry de fluxo?

Com cytometry de fluxo, as propriedades das pilhas podem ser determinadas. Isto é feito numa base individual para cada pilha e inclui medidas tais como o tamanho de pilha, a granulosidade, e a quantidade de componentes da pilha (tais como o ADN, o RNA de mensageiro, e proteínas intracelulares).

Os valores quantitativos derivados com cytometry de fluxo podem ser valores relativos e absolutos, mas são tipicamente relativos. O cytometry de fluxo é aplicado extensamente para identificar pilhas, pilhas da contagem, e detecta determinados marcadores ou micro-organismos.

Comparando a microscopia de fluorescência e o cytometry de fluxo

A microscopia de fluorescência e o cytometry de fluxo medem as quantidades quantitativas de componentes celulares; contudo, diferem nos aspectos de encontrar componentes celulares, o volume de pilhas que podem segurar, e a preparação da amostra antes da análise.

A microscopia de fluorescência pode mostrar como um componente é distribuído na pilha - uniformemente ou aglomerado em compartimentos anatômicos. Pode igualmente mostrar mesmo se essa concentração muda temporal ou permanece estática.

O cytometry de fluxo geralmente não pode especificar onde o componente é ficado exactamente dentro da pilha. Isto igualmente significa que quando o cytometry de fluxo determina um componente celular, o faz em um nível da inteiro-pilha, visto que a microscopia de fluorescência pode determinar componentes dentro dos compartimentos celulares.

A microscopia de fluorescência pode geralmente determinar componentes celulares para dez ou centenas de pilhas. O cytometry de fluxo, contudo, pode segurar volumes maiores até de centenas de milhares de pilhas. Além disso, o cytometry de fluxo pode usar propriedades fluorescentes para distinguir e classificar pilhas vivas nos milhares, quando a microscopia de fluorescência for incapaz desta.

Para preparar amostras para o cytometry de fluxo, as pilhas precisam de estar em uma suspensão monodispersed; a microscopia de fluorescência não exige esta. Além, a microscopia de fluorescência pode dar a informação sobre interacções celulares, que é rara ao usar o cytometry de fluxo.

Microscopia de fluorescência e cytometry de fluxo no uso

Como mencionado, quando a microscopia de fluorescência e o cytometry de fluxo conseguirem os mesmos objetivos mais largos, tem seus próprios benefícios e vantagens, fazendo os apropriados para papéis diferentes. Quando aplicada à mesma amostra, contudo, podem render resultados diferentes, como sugerido por alguma pesquisa estuda.

Por exemplo, quando usada para medir a fragmentação no sémen, cytometry do ADN de fluxo indicou umas medidas mais altas de dano dos espermatozóides. Mais especificamente, o cytometry de fluxo indicou dano que era 2,6 vezes maior em comparação com a microscopia de fluorescência.

Os peritos não são inteiramente certos porque esta diferença é observada.  Com microscopia de fluorescência, a subjetividade transforma-se uma edição além do que o comprimento das observações, porque as moléculas fluorescentes se tornam descoradas.

Contudo, o cytometry de fluxo igualmente tem algum espaço para a variabilidade. Há uns métodos diferentes para estabelecer a população do interesse e para calcular quantos eventos são positivos. Um ponto inicial deve ser ajustado para medir a porcentagem das moléculas positivas para o marcador fluorescente, mas este ponto inicial pode ser ajustado usando amostras de referência diferentes e, assim, variabilidade da causa entre estudos.

Além disso, para este estudo específico, a fragmentação do ADN nas pilhas pode ser dura de detectar. As intensidades fluorescentes são distribuídas dentro como a maneira que sobrepor o autofluorescence, que é uma emissão clara natural por estruturas tais como as mitocôndria.

Fontes

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Last Updated: Nov 20, 2018

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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