Cytometry de flujo comparado con microscopia de fluorescencia

La microscopia de fluorescencia y el cytometry de flujo son herramientas del bioanalysis usadas para cuantificar el número total y el tipo de células en una muestra. Ambos métodos tienen uso disperso pero difieren ligeramente en su uso.

Muestra dentro del microscopio fluorescente - por Micha Weber

Micha Weber | Shutterstock

¿Cuál es microscopia de fluorescencia?

La microscopia existió antes de cytometry de flujo y era una parte integrante de su revelado. Un microscopio fluorescente, en términos simples, es un microscopio liviano aumentado que utiliza una luz de intensidad más alta para excitar fluorophores en el espécimen.

La excitación de fluorophores (o de la especie fluorescente) los incita para emitir la luz en una energía más inferior con longitudes de onda más largas, que produce la imagen magnificada. Se aplica generalmente a las características específicas de la célula. La fluorescencia se logra usando los anticuerpos marcados con etiqueta con los fluorophores que apuntan características específicas. Sin embargo, la coloración puede también ser lejos menos específica.

¿Cuál es cytometry de flujo?

Con cytometry de flujo, las propiedades de células pueden ser cuantificadas. Esto se hace sobre una base individual para cada célula e incluye mediciones tales como talla de célula, granulosidad, y cantidad de componentes de la célula (tales como DNA, ARN de mensajero, y proteínas intracelulares).

Los valores cuantitativos derivados con cytometry de flujo pueden ser valores relativos y absolutos, pero son típicamente relativos. El cytometry de flujo se aplica extensamente para determinar las células, células de la cuenta, y descubre ciertos marcadores o microorganismos.

Comparar microscopia de fluorescencia y cytometry de flujo

La microscopia de fluorescencia y el cytometry de flujo miden las cantidades cuantitativas de componentes celulares; sin embargo, difieren en aspectos de localizar los componentes celulares, el volumen de células que pueden manejar, y la preparación de la muestra antes de análisis.

La microscopia de fluorescencia puede mostrar cómo un componente se distribuye en la célula - uniformemente o se agrupa en divisiones anatómicas. Puede también mostrar independientemente de si esa concentración cambia temporal o sigue siendo estática.

El cytometry de flujo no puede especificar generalmente donde el componente se establece exactamente dentro de la célula. Esto también significa que cuando el cytometry de flujo cuantifica un componente celular, lo hace en un nivel de la entero-célula, mientras que la microscopia de fluorescencia puede cuantificar componentes dentro de las divisiones celulares.

La microscopia de fluorescencia puede cuantificar generalmente los componentes celulares para los diez o los centenares de células. El cytometry de flujo, sin embargo, puede manejar volúmenes más grandes hasta de cientos de miles de células. Además, el cytometry de flujo puede utilizar propiedades fluorescentes para distinguir y para clasificación las células vivas en los millares, mientras que la microscopia de fluorescencia es incapaz de esto.

Para preparar las muestras para el cytometry de flujo, las células necesitan estar en una suspensión monodispersed; la microscopia de fluorescencia no requiere esto. Además, la microscopia de fluorescencia puede dar la información sobre acciones recíprocas celulares, que es rara al usar cytometry de flujo.

Microscopia de fluorescencia y cytometry de flujo funcionando

Según lo mencionado, mientras que la microscopia de fluorescencia y el cytometry de flujo logran las mismas metas más amplias, tienen sus propias ventajas y ventajas, haciéndolas convenientes para diversos papeles. Cuando están aplicados a la misma muestra, sin embargo, pueden rendir diversos resultados, como sugerido por una cierta investigación estudia.

Por ejemplo, cuando estaba utilizada para medir la fragmentación en semen, cytometry de la DNA de flujo indicó mediciones más altas del daño de los espermatozoides. Más concretamente, el cytometry de flujo indicó el daño que era 2,6 veces mayor en comparación con microscopia de fluorescencia.

Los expertos no están totalmente seguros porqué se observa esta diferencia.  Con microscopia de fluorescencia, la subjetividad se convierte en una entrega además del largo de las observaciones, porque las moléculas fluorescentes se blanquean.

Sin embargo, el cytometry de flujo también tiene cierta extensión para la variabilidad. Hay métodos diferentes para establecer la población de interés y para estimar cuántas acciones son positivas. Un umbral se debe fijar para medir el porcentaje de las moléculas positivas para el marcador fluorescente, pero este umbral se puede fijar usando diversas muestras de referencia y, así, variabilidad de la causa entre los estudios.

Además, para este estudio específico, la fragmentación de la DNA en células puede ser dura de descubrir. Las intensidades fluorescentes se distribuyen hacia adentro por ejemplo manera que recubren el autofluorescence, que es una emisión liviana natural al lado de las estructuras tales como mitocondrias.

Fuentes

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Last Updated: Nov 20, 2018

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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