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Técnicas de anticuerpo fluorescente

Desde su descubrimiento original en 1942, la coloración de la inmunofluorescencia ha seguido siendo una técnica altamente segura y potente para una amplia gama de propósitos de la investigación y del diagnóstico.

anticuerpos fluorescentesCélulas de la leucemia etiqueta con las moléculas fluorescentes. Haber de imagen: Vshivkova/Shutterstock.com

Las técnicas del anticuerpo de la fluorescencia (FA) implicarán generalmente el uso de células o de un anticuerpo, cuya región constante se ha marcado con etiqueta con una escritura de la etiqueta fluorescente conocida de otra manera como fluoróforo. Las técnicas del FA se categorizan a menudo como directas o indirectas.

Anticuerpo directo de la fluorescencia

La técnica directa del anticuerpo de la fluorescencia, que se puede referir de otra manera como inmunofluorescencia directa (DIF), implica el uso de un único anticuerpo primario fluorescente etiqueta que se utilice para atar a un antígeno del objetivo. Cuando está utilizado clínico, DIF es determinado útil para la diagnosis rápida de enfermedades bacterianas como Streptococcus pyogenes, que se conoce generalmente como strep, así como la pulmonía que es el resultado de cualquier especie de los pneumoniae del micoplasma y del pneumophilia de Legionella.

Para tales propósitos diagnósticos, la muestra paciente primero se coloca en una diapositiva del microscopio y en seguida se expone al anticuerpo fluorescente. Cualquier atascamiento entre el anticuerpo fluorescente-marcado con etiqueta y el antígeno del objetivo, que para estas situaciones serían bacterias, hará estas substancias iluminar sobre el examen con un microscopio de fluorescencia.  

Además de su uso como herramienta diagnóstica, DIF es también ampliamente utilizado para los estudios de la investigación científica. Para tales propósitos, una muestra de tejido congelada que se ha cortado en 5 o 6 micrómetros (µm) las secciones finas se coloca sobre una diapositiva de cristal.

Las diapositivas entonces se incuban con un anticuerpo fluorescente-marcado con etiqueta, que incluirá típicamente un panel de los anticuerpos que se dirigen contra los isotipos del anticuerpo de IgA, de IgG, y de IgM junto con el complemento 3, que se apunta contra el antígeno del interés.

Observe que la concentración del anticuerpo usado para este tipo de estudio será basada en los experimentos anteriores que han confirmado qué concentración puede lograr la índice más alta del señal-a-fondo.

Después de que las diapositivas se hayan incubado por lo menos 30 minutos en la oscuridad y en la temperatura ambiente, se lavan las diapositivas y entonces reflejado con un microscopio de fluorescencia.

anticuerpos fluorescentesHaber de imagen: anyaivanova/Shutterstock.com

Anticuerpo indirecto de la fluorescencia

Con respecto a la técnica de un solo paso usada para DIF, indirecto SI (IIF) o el FA indirecto (IFA) es un proceso de dos etapas que comienza con el uso de un anticuerpo primario sin etiqueta sobre la muestra que se dirige contra un antígeno del objetivo. El segundo paso de IIF implica el uso de un anticuerpo secundario fluorescente-etiqueta que se dirija contra la porción de Fc del anticuerpo primario.

Aunque IIF se considere ser complicado que DIF, pues dura para terminar y requiere el uso de dos anticuerpos compatibles, es superior en términos de sus capacidades de la sensibilidad.

Algunos usos clínicos comunes de las pruebas de IFA incluyen ésos usados para la diagnosis de la sífilis. Para este tipo de prueba de IFA, las células del paladio del T. que fueron aisladas previamente de un animal de la investigación se aíslan y se ponen sobre la superficie de una diapositiva de cristal. Un suero que se ha detectado de un paciente entonces se extiende por las células del paladio del T. a tener en cuenta anticuerpos anti-treponemales, si están presentes, atar a los antígenos fijos.

Después de que se quite la muestra del suero del paciente, se agrega un anticuerpo secundario que se ha marcado con etiqueta con un fluoróforo. Un resultado positivo de la sífilis iluminará todos los complejos conyugal anticuerpo-fluoróforos secundarios.

Otro tipo de IFA que es ampliamente utilizado en fijaciones clínicas es el que se utiliza para la diagnosis de eritematoso de lupus sistémico (SLE). Los pacientes con SLE, que es una enfermedad autoinmune, tendrán un nivel creciente de circular los autoanticuerpos antinucleares (ANA) que se apuntan contra la DNA y las diversas proteínas que atan a la DNA.

Para este tipo de prueba de IFA, las células se cultivan y después se ponen en una diapositiva de cristal. Cada diapositiva entonces se incuba con una diversa concentración del anticuerpo del paciente, que entonces se lava para quitar cualquier proteína desatada.

Después de que el paso de la estela turbulenta, un anticuerpo secundario fluorescente-etiqueta, que para la prueba de la ANECDOTARIO será antihuman IgG, se agregue a las diapositivas y se permita incubar. Un título de la ANECDOTARIO en el suero después se obtiene de la dilución más alta del suero que mostró fluorescencia y se utiliza para determinar una diagnosis de SLE.

Cytometry de flujo

El tercer tipo de técnica de anticuerpo fluorescente incluye cytometry de flujo, que es un sistema automatizado de la numeración celular que se puede utilizar para cuantificar las células específicas que están presentes en mezclas complejas tales como sangre o suero.

Un experimento típico del cytometry de flujo comenzará con la incubación de un anticuerpo fluorescente-etiqueta que se apunte contra una subpoblación específica de células, tales como anti-CD4, que puede atar a la glicoproteína CD4 encontrada en la superficie de diversas células inmunes incluyendo las células de ayudante de T, los monocitos, y los macrófagos. El cytometry de flujo puede también cuantificar la presencia de tipos múltiples de la célula usando fabricantes apropiados de la célula.

Después de que se haya terminado la incubación, la muestra entonces se introduce al cytometer del flujo. Dentro de esta máquina, una fuerza capilar estrecha las células presentes dentro de la muestra a moverse a través en un único archivo. Mientras que las células se mueven a través del capilar, un laser se utiliza para activar y para excitar cualquier célula que se haya marcado con etiqueta con el fluoróforo.

La intensidad de la fluorescencia de cada célula emocionada después es medida por los detectores adelante y de la lado-dispersión y representada en un histograma para el análisis. Independientemente de propósitos de la cuantificación, el cytometry y la inmunofluorescencia de flujo se pueden utilizar para clasificación las células en subpoblaciones purificadas con fines de investigación con una técnica conocida como compaginador fluorescencia-activado de la célula (FACS).

Referencias

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Last Updated: Mar 18, 2021

Benedette Cuffari

Written by

Benedette Cuffari

After completing her Bachelor of Science in Toxicology with two minors in Spanish and Chemistry in 2016, Benedette continued her studies to complete her Master of Science in Toxicology in May of 2018. During graduate school, Benedette investigated the dermatotoxicity of mechlorethamine and bendamustine; two nitrogen mustard alkylating agents that are used in anticancer therapy.

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