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DNA di futuro che ordina le tecniche

L'ordinamento del DNA ha subito gli avanzamenti radicali da quando il primo Sanger che ordina il metodo è stato presentato nel 1977. Ordinamento di Sanger usato aggiunto a caso catena-terminando i deoxynucleotides durante la sintesi del DNA per generare le catene del DNA delle lunghezze che differiscono da una coppia di basi. Quelli poi sono stati separati su un gel di poliacrilammide e “legga„ da sinistra a destra come un libro. Oggi, c'è una grande selezione dei metodi migliori con i risultati rapidi e precisi.

Sequenza del DNA. Credito di immagine: Gio.tto/Shutterstock
Sequenza del DNA. Credito di immagine: Gio.tto/Shutterstock

Dal metodo di Sanger per scegliere ordinamento della molecola

Verso la fine degli anni 90 e di 2000s, il progetto Genoma Umano ha determinato i miglioramenti sul metodo suddetto di Sanger che ha compreso l'intero ordinamento del fucile da caccia del genoma ed i metodi d'ordinamento di prossima generazione. Rompendo sulle grandi sequenze di DNA ed ordinandole simultaneamente ad un modo in maniera massiccia parallelo, i dati hanno potuto essere generati più velocemente. Con il miglioramento delle tecnologie informatiche, la sequenza potrebbe poi essere riunita e gli interi genoma hanno cominciato ad essere decodificati.

Le società come Solexa e le tecnologie di vita sono migliorato su quei metodi ancora una volta, creando la generazione seguente che ordina le tecnologie. Nella generazione seguente che ordina, i frammenti del modello del DNA sono fissati alle superfici solide come le lastre di vetro o alle microperle per la manipolazione automatizzata e più alta di capacità di lavorazione. Alcune innovazioni chimiche si sono aggiunte nell'ordinamento della seconda generazione. Questi metodi sono stati messi a punto e guadagnato la popolarità nel 2000s.

Ancora i più nuovi metodi sono ora sull'orizzonte. La sola sequenza della molecola (SMS) è un approccio che oltrepassa l'amplificazione dalla PCR, un punto cruciale in tutte le tecnologie della generazione seguente. L'amplificazione di PCR moltiplica la sequenza di DNA originale del modello per le centinaia o migliaia di periodi in moda da poterla visualizzare con i metodi ottici di rilevazione.

I metodi di SMS interrogano una singola molecola del DNA, sormontando i problemi e le tendenziosità introdotti tramite il trattamento di PCR. I vantaggi potenziali di SMS sopra l'ordinamento di prossima generazione comprendono il tempo complessivo più veloce, più lungamente leggono le lunghezze, più alta accuratezza, meno prodotto base e più a basso costo. È stimato che con SMS, un intero genoma potrebbe essere ordinato per il poco quanto $100.

Analisi genetica di Helicos

La piattaforma genetica dell'analisi di Helicos ordina le diverse molecole del DNA tenute da adesivo ad una superficie piana mentre sono estese. Analoghi fluorescente contrassegnati del nucleotide, chiamati nucleotidi di Virtual Terminator. Questa tecnologia ancora richiede una pausa dopo che ogni giro dell'estensione per leggere la sequenza, ma elimina il punto di PCR richiesto per le tecnologie di prossima generazione come Illumina e Roche 454.

Le tariffe di errore crude sull'ordinamento del filo determinato del DNA sono più di 5 per cento. Tuttavia quando ordinano è effettuato in un modo altamente parallelo, l'accuratezza di sequenza rifinita consenso è oltre 99 per cento. Questo metodo può anche essere usato per ordinare direttamente il RNA, dal transcriptase inverso di sostituzione per la DNA polimerasi. L'analisi genetica di Helicos è stata usata per ordinare nel 2009 il genoma di uno dei sui co-fondatori, il Dott. Stephen Quake, per $50.000 di sotto. Tuttavia, Helicos successivamente file per fallimento di capitolo 11 nel 2012.

Ordinamento in tempo reale della singola molecola

Le scienze biologiche pacifiche hanno sviluppato la singola molecola in tempo reale (SMRT) ordinando il metodo, che è basato direttamente sull'osservazione della sintesi di singolo filo di DNA. L'ordinamento di SMRT usa una camera del nanometro-disgaggio per isolare un singolo filo e la DNA polimerasi del DNA. La molecola della DNA polimerasi è ancorata e poi è sommersa dai nucleotidi fluorescente contrassegnati.

I nucleotidi possono essere individuati mentre si diffondono giù al filo rilegato del DNA e sono riconosciuti ed incorporati dalla DNA polimerasi. La diffusione ed il trattamento di estensione accade nei millisecondi, in modo da significa che la DNA polimerasi si aggiunge parecchie basi al secondo. Poiché la tintura fluorescente è fissata al nucleotide attraverso una catena del fosfato, disconnette dal nucleotide durante la reazione della DNA polimerasi, liberantesi dalla catena crescente del DNA.

Un vantaggio importante delle tecnologie di SMS è che ordinano continuamente la molecola, piuttosto che facendo una pausa per leggere dopo ogni giro di estensione della base. Inoltre, il metodo ha la tendenza a generare la sequenza più lunga legge una volta confrontato oggi ad altre piattaforme sul servizio.

Sorgenti

  1. http://smrt.med.cornell.edu/
  2. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0022283675902132/
  3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC431765/
  4. https://www.genomeweb.com/sequencing/helicos-biosciences-files-chapter-11-bankruptcy-protection

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Catherine Shaffer

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Dr. Catherine Shaffer

Catherine Shaffer is a freelance science and health writer from Michigan. She has written for a wide variety of trade and consumer publications on life sciences topics, particularly in the area of drug discovery and development. She holds a Ph.D. in Biological Chemistry and began her career as a laboratory researcher before transitioning to science writing. She also writes and publishes fiction, and in her free time enjoys yoga, biking, and taking care of her pets.

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