ADN do Futuro que Arranja Em Seqüência Técnicas

Por Catherine Shaffer, M.Sc.

Arranjar em seqüência do ADN submeteu-se a avanços radicais desde que o primeiro Sanger que arranja em seqüência o método foi introduzido em 1977. Arranjar em seqüência de Sanger utilizado adicionado aleatòria corrente-terminando deoxynucleotides durante a síntese do ADN para gerar correntes do ADN dos comprimentos que diferem por um par baixo. Aqueles foram separados então em um gel de polyacrylamide e “leia” esquerda para a direita como um livro. Hoje, há um vasto leque de métodos melhorados com resultados rápidos e precisos.

Seqüência do ADN. Crédito de Imagem: Gio.tto/Shutterstock
Seqüência do ADN. Crédito de Imagem: Gio.tto/Shutterstock

Do Método de Sanger Para Escolher Arranjar Em Seqüência da Molécula

No final dos anos 90 e de 2000s, o Projecto de Genoma Humano conduziu melhorias no método acima mencionado de Sanger que incluiu arranjar em seqüência e próxima geração inteiras da espingarda do genoma que arranjam em seqüência métodos. Quebrando acima grandes seqüências do ADN e arranjando em seqüência as simultaneamente em uma forma maciça paralela, os dados podiam ser gerados mais rapidamente. Com melhoramento da informática, a seqüência poderia então ser remontada e os genomas inteiros começaram a ser descodificados.

As Empresas como Solexa e as Tecnologias da Vida melhoraram naqueles métodos contudo outra vez, criando a próxima geração que arranja em seqüência tecnologias. Na próxima geração que arranja em seqüência, os fragmentos do molde do ADN são anexados às superfícies contínuas como placas de vidro ou aos microbeads para a manipulação mais automatizada, mais alta da produção. Algumas inovações químicas foram adicionadas em arranjar em seqüência da segunda geração. Estes métodos foram desenvolvidos e ganharam a popularidade no 2000s.

Mesmo uns métodos mais novos estão agora no horizonte. Único arranjar em seqüência da molécula (SMS) é uma aproximação que contorneie a amplificação pelo PCR, uma etapa crucial em todas as tecnologias da próxima geração. A amplificação do PCR multiplica o fragmento original do ADN do molde por centenas ou por milhares de épocas de modo que possa ser visualizada por métodos de detecção ópticos.

Os métodos de SMS interrogam uma única molécula do ADN, superando os problemas e as polarizações introduzidos pelo processo do PCR. As vantagens potenciais de SMS sobre arranjar em seqüência da próxima geração incluem um tempo de resposta mais rápido, lêem mais por muito tempo comprimentos, uma precisão mais alta, menos material começar, e mais barato. Calcula-se que com SMS, um genoma inteiro pôde ser arranjado em seqüência para o tão pouco quanto $100.

Análise Genética de Helicos

A Plataforma Genética da Análise de Helicos arranja em seqüência as moléculas individuais do ADN ligadas a uma superfície plana enquanto são prolongadas. Analogs Fluorescente etiquetados do nucleotide, chamados nucleotides de Virtual Terminal. Esta tecnologia ainda exige uma pausa depois que cada círculo da extensão para ler a seqüência, mas elimina a etapa do PCR exigida para tecnologias da próxima geração como Illumina e Roche 454.

As taxas de erro cruas em arranjar em seqüência uma costa individual do ADN são mais de 5 por cento. Contudo, ao arranjar em seqüência é realizado em uma maneira altamente paralela, a precisão terminada consenso da seqüência está sobre 99 por cento. Este método pode igualmente ser usado para arranjar em seqüência directamente o RNA, pelo transcriptase reverso de substituição para a polimerase de ADN. A Análise Genética de Helicos foi usada para arranjar em seqüência em 2009 o genoma de um de seus co-fundadores, Dr. Stephen Tremer, para $50.000 inferiores. Contudo, Helicos arquivou subseqüentemente para a falência do Capítulo 11 em 2012.

Único Arranjar Em Seqüência do Tempo Real da Molécula

As Ciências Biológicas Pacíficas desenvolveram o Único Tempo Real da Molécula (SMRT) que Arranja Em Seqüência o método, que é baseado directamente em observar a síntese de uma única costa do ADN. Arranjar em seqüência de SMRT utiliza uma câmara da nanômetro-escala para isolar uma única costa do ADN e a polimerase de ADN. A molécula da polimerase de ADN é ancorada e inundada então com os nucleotides fluorescente etiquetados.

Os nucleotides podem ser detectados enquanto difundem para baixo à costa encadernada do ADN e são reconhecidos e incorporados pela polimerase de ADN. A difusão e o processo da extensão acontecem nos milissegundos, assim que significa que a polimerase de ADN está adicionada diverso por segundo das bases. Porque a tintura fluorescente é anexada ao nucleotide através de uma corrente do fosfato, desliga do nucleotide durante a reacção da polimerase de ADN, livrando-se da corrente crescente do ADN.

Uma vantagem importante de tecnologias de SMS é que arranjam em seqüência a molécula continuamente, um pouco do que pausando para ler após cada círculo da extensão baixa. Também, o método tem a propensão gerar uma seqüência mais longa lê quando comparado a outras plataformas no mercado hoje.

Revisto perto: Dr. Tomislav Meštrović, DM, PhD

Fontes

  1. http://smrt.med.cornell.edu/
  2. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0022283675902132/
  3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC431765/
  4. https://www.genomeweb.com/sequencing/helicos-biosciences-files-chapter-11-bankruptcy-protection

[Leitura Adicional: Arranjar em seqüência do ADN]

Last Updated: Sep 11, 2017

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