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Dérivés de GFP : PCP et YFP

La protéine fluorescente verte (GFP) est une protéine bioluminescente de polypeptide qui est extraite des méduses (Aequorea Victoria). Une protéine, connue sous le nom d'aequorin, dans Aequorea Victoria expose la lumière bleue quand elle grippe avec du calcium. Le GFP absorbe complet cette lumière bleue et l'émet comme lumière verte.

Crédit : molekuul_be/Shutterstock.com

Quelques variantes de GFP sont employées en tant que les biocapteurs intracellulaires non envahissants de pH ou indicateurs fluorescents pour des concentrations locales2+ de Ca. Récent, l'installation de cette technologie a été améliorée par le développement des variantes de GFP avec les spectres modifiés de fluorescence.

Ces GFP différemment colorés pourraient à l'avenir s'avérer très utiles pour marquer les populations distinctes de protéine ou les organelles cellulaires pour de doubles ou multiple-marquantes expériences. Bien qu'une variante bleu-changée de vitesse de GFP (BFP) puisse être spectralement résolue du GFP, elle a une puissance de tranche de temps inférieure et n'est pas photostable, qui limite son utilité. Sur contraire, les mutants récent produits du GFP avec le spectre d'émission (PCP) jaune-changé de vitesse (YFP) et bleu-vert-changé de vitesse sont hautement stables et plus lumineux, si comparés à BFP.

Protéines fluorescentes bleu-vert d'Aequorea (PCP)

Des variantes bleu-vert de la couleur (PCP) qui sont extraites de l'Aequorea GFP sont considérées une alternative parfaite à BFPs. La fluorescence bleu-vert existe en raison du remplacement de Tyr66 avec du tryptophane. Une version améliorée de protéine bleu-vert de fluorescence a été produite en ajoutant plusieurs remplacements à l'intérieur de la structure du β-baril environnant.

De plus, le spectre fluorescent bleu-vert amélioré complexe (ECFP) d'excitation de protéine déclare que le nombre de substance enthousiaste de condition pour ECFP est toujours plus grand qu'un, et ceci a été éventuellement conclu utilisant des mesures de la vie de fluorescence.

Les remplacements visés sur l'ECFP apprêtent exposé au solvant ont eu comme conséquence des variantes performantes (cerulean) dans des caractéristiques complexes de condition excitées par ECFP. La condition enthousiaste du cerulean est comparée simple à ECFP. Elle a augmenté le coefficient d'extinction de puissance et de haut de tranche de temps. Le Cerulean est considéré comme dérivé le plus utile d'Aequorea.

protéines fluorescentes vert jaunâtre d'Aequorea (YFP)

Le YFP sont les variantes d'Aequorea GFP qui émettent les plus longues longueurs d'onde et elles sont produites une fois quand la structure cristalline indigène de GFP est examinée. La recherche conduite utilisant des rayons X prouvent que le chromophore s'étendent dans la grande proximité au résidu dans le β-baril. En cette position, les remplacements ont eu la capacité pour varier le profil spectral de la protéine.

EYFP, la version améliorée du YFP, est la protéine fluorescente la plus très utilisée. Cependant, la sensibilité de pH est très élevée en conditions acides, car elle détruit la moitié de sa fluorescence quand elle subit l'interaction.

En outre, EYFP est extrêmement sensible aux ions du chlorure et a la propriété faible de stabilité de photo avec d'autres variantes de point de gel d'Aequorea. Cependant, la sensibilité environnementale du YFP a été complet utilisée par des chercheurs pour développer les biocapteurs qui sont employés pour mesurer les concentrations en ion de chlorure et le pH cytoplasmique.

On a introduit différentes variantes d'EYFP qui peuvent être utiles dans beaucoup d'applications spécialisées. La protéine fluorescente jaune superbe (SYFP) est considérablement plus lumineuse que la protéine de parent une fois exprimée en cellules mammifères et de bactéries.

PCP et YFP sur le GFP

L'expression du gène de journaliste en cellules souche adultes (ASCs) a des applications larges dans la recherche de cellule souche. La capacité de suivre des cellules souche adultes quand protéger par fusible un gène non-cytotoxique et fluorescent de journaliste dans le génome d'ASC est particulièrement désiré pour la recherche de greffe de cellules souches.

Des investigations rapides sur le fonctionnement de cellules et l'ion de protéine peuvent être réalisées utilisant les protéines fluorescentes. En revanche, la disponibilité d'exprimer stablement des tensions de cellules avec la variabilité inférieure d'expression pour la recherche à long terme est très complexe. Une des raisons de cette complexité est la cytotoxicité du GFP.

En plus du GFP, le YFP et la PCP ont été évalués pour éviter les effets de toxicité qui sont particulièrement provoqués par GFP tandis que l'inscription stable est essayée sur la tension hépatique d'ASC de rat. Des clones fluorescents stables qui expriment le YFP ou la PCP ont été développés tandis qu'il était difficile de développer la GFP-expression stable tend.

CyPet et YPet

Une autre variante d'EYFP a été développée en s'appliquant la stratégie révolutionnaire de mutagénèse dirigée aux ADNc qui codent une paire jointe de YFP-CFP. L'objectif de ce développement de variante d'EYFP était de subir une mutation le YFP et la PCP simultanément et de sélecter les paires qui ont le rendement amélioré de FRETTE. Les bibliothèques d'ADNc ont été directement évaluées pour le rendement de FRETTE et les meilleurs clones ont été trouvés.

Ces clones ont été soumis à brouiller synthétique d'ADN et à beaucoup de cycles révolutionnaires de mutagénèse dirigée faite au hasard. Ce procédé avait eu comme conséquence le développement de CyPet-YPet (pour la protéine fluorescente jaune ou bleu-vert pour le transfert d'énergie), qui est une paire neuve de CFP-YFP qui avait montré l'amélioration quadruple dans la FRETTE quotientométrique.

Un montant de sept mutations que nous avons empilées dans la PCP quand l'évolution dirigée est effectuée pour fournir CyPet. Ces mutations ont comporté l'émission et l'absorption maximum à 477 nanomètre et à 435 nanomètre, respectivement. Cependant, CyPet ne peut pas être employé pour des applications autonomes car sa brilliance est moins que le cerulean. En revanche, YPet est le comparé variable le plus lumineux à toutes les variantes de YFP et montre l'excellente stabilité de photo.

Supplémentaire, YPet a la résistivité la plus élevée dans un milieu acide comparé à tous autres dérivés de YFP et par conséquent est employé dans les biocapteur-combinaisons visées aux organelles acides. Récent, on l'a expliqué que les signes améliorés de FRETTE avaient résulté des mutations de V224L et de S208F, qui peuvent être agies sur les composés intramoléculaires qui sont formés entre le YPet et le CyPet joints.

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Last Updated: Jan 25, 2019

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