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Derivati di GFP: CFP e YFP

La proteina fluorescente verde (GFP) è una proteina bioluminescenta del polipeptide che è estratta dalle meduse (Aequorea Victoria). Una proteina, conosciuta come il aequorin, in Aequorea Port Victoria espone l'indicatore luminoso blu quando lega con calcio. GFP completamente assorbe questo indicatore luminoso blu e lo emette come luce verde.

Credito: molekuul_be/Shutterstock.com

Varianti di qualche GFP sono usate come i biosensori intracellulari non invadenti di pH o indicatori fluorescenti per le concentrazioni locali2+ di Ca. Recentemente, l'utilità di questa tecnologia è stata migliorata tramite lo sviluppo delle varianti di GFP con gli spettri alterati della fluorescenza.

Questi GFPs diversamente colorato hanno potuto in futuro risultare essere molto utili per la tracciatura le popolazioni distinte della proteina o degli organelli cellulari per gli esperimenti doppio o dicontrassegni. Sebbene una variante blu-spostata di GFP (BFP) possa essere spettrale risolta da GFP, ha un rendimento quantico basso e non è photostable, che limita la sua utilizzabilità. Su contrario, i mutanti recentemente generati di GFP con lo spettro di emissione giallo-spostato (YFP) e ciano-spostato (CFP) sono altamente stabili e più luminosi, una volta confrontati a BFP.

Ciano proteine fluorescenti di Aequorea (CFP)

Le ciano varianti di colore (CFP) che sono estratte dal Aequorea GFP sono considerate come un'alternativa perfetta a BFPs. La ciano fluorescenza esiste come conseguenza della sostituzione di Tyr66 con triptofano. Una versione migliorata di ciano proteina della fluorescenza è stata generata aggiungendo parecchie sostituzioni dentro la struttura del β-barilotto circostante.

Inoltre, il ciano spettro fluorescente migliorato complesso (ECFP) di eccitazione della proteina specifica che il numero delle specie dello stato eccitato per ECFP è sempre maggior di uno e questo finalmente è stato concluso facendo uso delle misure della vita della fluorescenza.

Le sostituzioni mirate a sul ECFP affiorano esposto al solvente hanno provocato le varianti ad alto rendimento (ceruleo) nelle caratteristiche complesse dello stato eccitato di ECFP. Lo stato eccitato del ceruleo è semplice confrontato a ECFP. Ha aumentato il rendimento quantico e l'alto coefficiente di estinzione. Il ceruleo è considerato come il derivato più utile di Aequorea.

proteine fluorescenti Giallastro verdi di Aequorea (YFP)

YFP sono varianti di Aequorea GFP che emettono le lunghezze d'onda più lunghe e siano generate una volta quando il sistema cristallino indigeno di GFP è ispezionato. La ricerca condotta facendo uso dei raggi x indica che il cromoforo risiede nella grande prossimità al residuo in β-barilotto. In questa posizione, le sostituzioni hanno avute la capacità per variare il profilo spettrale della proteina.

EYFP, la versione migliorata di YFP, è la proteina fluorescente più ampiamente usata. Tuttavia, la sensibilità di pH è molto alta nelle circostanze acide, poichè perde la metà della sua fluorescenza quando subisce l'interazione.

Inoltre, EYFP è altamente sensibile agli ioni del cloruro ed ha beni difficili della stabilità della foto rispetto ad altre varianti di Aequorea FP. Tuttavia, la sensibilità ambientale di YFP completamente è stata utilizzata dai ricercatori per sviluppare i biosensori che sono usati per misurare le concentrazioni nello ione del cloruro ed il pH citoplasmico.

Le varianti differenti di EYFP sono state introdotte che possono essere utili in molte applicazioni specializzate. La proteina fluorescente gialla eccellente (SYFP) è considerevolmente più luminosa della proteina del genitore una volta espressa in celle dei batteri e mammifere.

CFP e YFP su GFP

L'espressione genica del reporter in cellule staminali adulte (ASCs) ha ampie applicazioni nella ricerca della cellula staminale. La capacità di tenere la carreggiata le cellule staminali adulte quando fondere un gene non citotossico e fluorescente del reporter nel genoma del CSA specificamente è desiderata per la ricerca di trapianto della cellula staminale.

Le indagini rapide sulla funzione delle cellule e sullo ione della proteina possono essere raggiunte facendo uso delle proteine fluorescenti. Al contrario, la disponibilità stabile di espressione degli sforzi delle cellule con la variabilità bassa di espressione per la ricerca a lungo termine è molto complessa. Una delle ragioni per questa complessità è la citotossicità di GFP.

Oltre a GFP, YFP ed il CFP sono stati valutati per impedire gli effetti della tossicità che specificamente sono causati da GFP mentre la marcatura stabile è tentata su razza epatica del ratto il CSA. I cloni fluorescenti stabili che esprimono YFP o il CFP sono stati sviluppati mentre era difficile da sviluppare l'GFP-espressione stabile sforza.

CyPet e YPet

Un'altra variante di EYFP è stata sviluppata applicando la strategia rivoluzionaria di mutagenesi ai cDNAs che codificano un paio collegato di YFP-CFP. L'obiettivo di questo sviluppo della variante di EYFP era di subire una mutazione simultaneamente YFP ed il CFP e di selezionare le paia che hanno migliorato il risparmio di temi del CERCHIO. Le librerie del cDNA direttamente sono state valutate per risparmio di temi del CERCHIO ed i migliori cloni sono stati individuati.

Questi cloni sono stati sottoposti alla mescolanza del DNA del sintetico ed a molti cicli rivoluzionari di mutagenesi casuale. Questo trattamento aveva provocato lo sviluppo di CyPet-YPet (per proteina fluorescente gialla o ciano per il trasferimento di energia), che è un nuovo paio di CFP-YFP che aveva indicato il potenziamento quadruplo nel CERCHIO logometrico.

Una somma di sette mutazioni che abbiamo impilato nel CFP quando l'evoluzione diretta è effettuata per rendere CyPet. Queste mutazioni hanno caratterizzato l'emissione e l'assorbimento massimi a 477 nanometro e a 435 nanometro, rispettivamente. Tuttavia, CyPet non può essere usato per le applicazioni autonome poichè la sua luminosità è di meno che il ceruleo. Al contrario, YPet è la variante più luminosa confrontata a tutte le varianti di YFP ed esibisce la stabilità eccellente della foto.

Ulteriormente, YPet ha il più alta resistività in un ambiente acido confrontato a tutti i altri derivati di YFP e quindi è utilizzato nelle biosensore-combinazioni mirate a agli organelli acidi. Recentemente, è stato dimostrato che i segnali migliori del CERCHIO erano derivato dalle mutazioni di S208F e di V224L, che possono essere agite sopra i complessi intramolecolari che sono formati fra il YPet e il CyPet collegati.

Sorgenti:

  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2910338/
  2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1242169/
  3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20360360
  4. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18401450
  5. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC94594/
  6. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3190146/
  7. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8777060
  8. http://pdb101.rcsb.org/motm/42
  9. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC106306/
  10. http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm
  11. http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/probes/jellyfishfps.html
  12. https://www.researchgate.net/profile/David_Miller_III/publication/12960328_Two-color_GFP_expression_system_for_C_elegans/links/0c9605187cae61aa53000000.pdf

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Last Updated: Jan 25, 2019

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