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Derivados de GFP: CFP e YFP

A proteína fluorescente verde (GFP) é uma proteína bioluminescent do polipeptídeo que seja extraída das medusa (Aequorea victoria). Uma proteína, conhecida como o aequorin, em Aequorea Victoria expor a luz azul quando liga com cálcio. GFP absorve completamente esta luz azul e emite-se a como uma luz verde.

Crédito: molekuul_be/Shutterstock.com

As variações de algum GFP são usadas como biosensors intracelulares não invasores do pH ou indicadores fluorescentes para concentrações locais2+ do Ca. Recentemente, o serviço público desta tecnologia foi aumentado pela revelação de variações de GFP com espectros alterados da fluorescência.

Estes GFPs diferentemente colorido puderam no futuro provar ser muito úteis para marcar populações distintas da proteína ou os organelles celulares para experiências dobro ou múltiplo-etiquetando. Embora uma variação azul-deslocada de GFP (BFP) possa spectrally ser resolvida de GFP, tem um baixo rendimento de quantum e não é photostable, que limite sua utilidade. Em contrário, os mutantes recentemente gerados de GFP com espectro de emissão (CFP) amarelo-deslocado (YFP) e ciano-deslocado são altamente estáveis e mais brilhantes, quando comparados a BFP.

Proteínas fluorescentes cianas de Aequorea (CFP)

As variações cianas da cor (CFP) que são extraídas do Aequorea GFP são consideradas ser uma alternativa perfeita a BFPs. A fluorescência ciana existe em conseqüência da substituição de Tyr66 com triptofano. Uma versão aumentada da proteína ciana da fluorescência foi gerada adicionando diversas substituições dentro da estrutura de β-tambor circunvizinho.

Além, o espectro fluorescente ciano aumentado complexo (ECFP) da excitação da proteína indica que o número de espécie do estado entusiasmado para ECFP é sempre maior de um, e este tem sido concluído eventualmente usando medidas da vida da fluorescência.

As substituições visadas no ECFP surgem expor ao solvente conduziram às variações de capacidade elevada (cerulean) em características complexas do estado entusiasmado de ECFP. O estado entusiasmado de cerulean é simples comparado a ECFP. Aumentou o rendimento de quantum e o coeficiente de extinção alto. O Cerulean é considerado como o derivado o mais útil de Aequorea.

proteínas fluorescentes Amarelado-verdes de Aequorea (YFP)

YFP são as variações de Aequorea GFP que se emitem os comprimentos de onda os mais longos e estão gerados uma vez quando a estrutura de cristal nativa de GFP é inspeccionada. A pesquisa conduziu usando raios X mostra que o cromóforo coloca na grande proximidade ao resíduo no β-tambor. Nesta posição, as substituições tiveram a capacidade para variar o perfil espectral da proteína.

EYFP, a versão aumentada de YFP, é a proteína fluorescente a mais amplamente utilizada. Contudo, a sensibilidade do pH é muito alta em circunstâncias ácidas, porque perde a metade de sua fluorescência quando se submete à interacção.

Também, EYFP é altamente sensível aos íons do cloreto e tem a propriedade deficiente da estabilidade da foto comparada com outras variações de Aequorea FP. Contudo, a sensibilidade ambiental de YFP foi utilizada completamente por pesquisadores para desenvolver os biosensors que são usados para medir concentrações do íon do cloreto e o pH citoplasmática.

As variações diferentes de EYFP foram introduzidas que podem ser úteis em muitas aplicações especializadas. A proteína fluorescente amarela super (SYFP) é consideravelmente mais brilhante do que a proteína do pai quando expressada em pilhas mamíferas e das bactérias.

CFP e YFP em GFP

A expressão genética do repórter em células estaminais adultas (ASCs) tem aplicações largas na pesquisa da célula estaminal. A capacidade para seguir células estaminais adultas quando fundir um gene não-citotóxico, fluorescente do repórter no genoma do ASC for desejada especificamente para a pesquisa da transplantação da célula estaminal.

As investigações rápidas da função da pilha e do íon da proteína podem ser conseguidas usando proteínas fluorescentes. Ao contrário, a disponibilidade estàvel de expressar tensões da pilha com baixa variabilidade da expressão para a pesquisa a longo prazo é muito complexa. Uma das razões para esta complexidade é a citotoxidade de GFP.

Além do que GFP, YFP e o CFP foram avaliados para impedir os efeitos da toxicidade que estão causados especificamente por GFP quando a marcação estável for tentada na tensão hepática do ASC do rato. Os clone fluorescentes estáveis que expressam YFP ou CFP foram desenvolvidos quando era difícil desenvolver GFP-expressar estável esticam.

CyPet e YPet

Uma outra variação de EYFP foi desenvolvida aplicando a estratégia revolucionária da mutagênese aos cDNAs que codificam um par ligado de YFP-CFP. O objetivo desta revelação da variação de EYFP era transformar simultaneamente YFP e CFP e seleccionar os pares que aumentaram a eficiência da FRICÇÃO. As bibliotecas do cDNA foram avaliadas directamente para a eficiência da FRICÇÃO e os melhores clone foram detectados.

Estes clone foram sujeitados a baralhar sintético do ADN e a muitos ciclos revolucionários de mutagêneses aleatórias. Este processo tinha conduzido à revelação de CyPet-YPet (para a proteína fluorescente amarela ou ciana para transferência de energia), que é um par novo de CFP-YFP que mostre o realce da quatro-dobra na FRICÇÃO ratiometric.

Uma soma de sete mutações que nós empilhamos no CFP quando a evolução dirigida for realizada para render CyPet. Estas mutações caracterizaram a emissão e a absorção máximas em 477 nanômetro e em 435 nanômetro, respectivamente. Não obstante, CyPet não pode ser usado para aplicações autônomas porque seu brilho é menos do que o cerulean. Ao contrário, YPet é a variação a mais brilhante comparada a todas as variações de YFP e exibe a estabilidade excelente da foto.

Adicionalmente, YPet tem a resistividade a mais alta em um ambiente ácido comparado a todos derivados restantes de YFP e daqui é usado nas biosensor-combinações visadas nos organelles ácidos. Recentemente, demonstrou-se que os sinais melhorados da FRICÇÃO tinham resultado das mutações de V224L e de S208F, que podem ser actuadas em cima dos complexos intra-moleculars que são formados entre o YPet e o CyPet ligados.

Fontes:

  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2910338/
  2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1242169/
  3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20360360
  4. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18401450
  5. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC94594/
  6. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3190146/
  7. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8777060
  8. http://pdb101.rcsb.org/motm/42
  9. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC106306/
  10. http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm
  11. http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/probes/jellyfishfps.html
  12. https://www.researchgate.net/profile/David_Miller_III/publication/12960328_Two-color_GFP_expression_system_for_C_elegans/links/0c9605187cae61aa53000000.pdf

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Last Updated: Jan 25, 2019

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