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Derivados de GFP: CFP y YFP

La proteína fluorescente verde (GFP) es una proteína bioluminiscente del polipéptido que se extrae de las medusas (Aequorea Victoria). Una proteína, conocida como aequorin, en Aequorea Victoria expone la luz azul cuando ata con calcio. GFP absorbe totalmente esta luz azul y la emite como luz verde.

Haber: molekuul_be/Shutterstock.com

Las variantes de algún GFP se utilizan como biosensores intracelulares no invasores del pH o indicadores fluorescentes para las concentraciones locales2+ del Ca. Recientemente, la utilidad de esta tecnología ha sido aumentada por el revelado de las variantes de GFP con espectros alterados de la fluorescencia.

Éstos GFPs diferentemente coloreado pudieron en futuro demostrar ser muy útiles para marcar las poblaciones distintas de la proteína o los organelos celulares para los experimentos dobles o de múltiple-etiquetas. Aunque una variante azul-cambio de GFP (BFP) pueda ser espectral resuelta de GFP, tiene un rendimiento de quantum inferior y no es photostable, que limita su utilidad. En contrario, los mutantes recientemente generados de GFP con espectro de emisión amarillo-cambio (YFP) y color cianita-cambio (CFP) son altamente estables y más brillantes, cuando están comparados a BFP.

Proteínas fluorescentes color cianita de Aequorea (CFP)

Las variantes color cianita del color (CFP) que se extraen del Aequorea GFP se consideran ser una opción perfecta a BFPs. La fluorescencia color cianita existe como resultado de la substitución de Tyr66 con triptófano. Una versión aumentada de la proteína color cianita de la fluorescencia ha sido generada agregando varias substituciones dentro de la estructura del β-cañón de arma de fuego circundante.

Además, el espectro fluorescente color cianita aumentado complejo (ECFP) de la excitación de la proteína declara que el número de especie del estado emocionado para ECFP es siempre mayor de uno, y esto se ha concluido eventual usando mediciones del curso de la vida de la fluorescencia.

Las substituciones apuntadas en el ECFP alisan expuesto al disolvente dieron lugar a las variantes de alto rendimiento (cerulean) en características complejas del estado emocionado de ECFP. El estado emocionado del cerulean es simple comparado a ECFP. Ha aumentado el rendimiento de quantum y el alto coeficiente de extinción. El cerulean se considera como el derivado más útil de Aequorea.

proteínas fluorescentes Amarillento-verdes de Aequorea (YFP)

YFP son las variantes de Aequorea GFP que emiten las longitudes de onda más largas y se generan una vez cuando se revisa la estructura cristalina nativa de GFP. La investigación conducto usando radiografías muestra que el cromóforo pone en gran proximidad al residuo en β-cañón de arma de fuego. En esta posición, las substituciones tenían la capacidad para variar el perfil espectral de la proteína.

EYFP, la versión aumentada de YFP, es la proteína fluorescente más ampliamente utilizada. Sin embargo, la sensibilidad del pH es muy alta en condiciones ácidas, pues pierde mitad de su fluorescencia cuando experimenta la acción recíproca.

También, EYFP es altamente sensible a los iones del cloruro y tiene propiedad pobre de la estabilidad de la foto comparada con otras variantes del punto de congelación de Aequorea. Sin embargo, la sensibilidad ambiental de YFP ha sido utilizada totalmente por los investigadores para desarrollar los biosensores que se utilizan para medir concentraciones del ión del cloruro y el pH citoplásmico.

Se han introducido diversas variantes de EYFP que pueden ser útiles en muchos usos especializados. La proteína fluorescente amarilla estupenda (SYFP) es considerablemente más brillante que la proteína del padre cuando está expresada en células mamíferas y de las bacterias.

CFP y YFP en GFP

La expresión génica del reportero en células madres adultas (ASCs) tiene usos amplios en la investigación de la célula madre. La capacidad de rastrear a las células madres adultas cuando fundir un gen no-citotóxico, fluorescente del reportero en el genoma del ASC se desea específicamente para la investigación del trasplante de la célula madre.

Las investigaciones rápidas de la función de la célula y del ión de la proteína se pueden lograr usando las proteínas fluorescentes. En cambio, la disponibilidad estable de expresar deformaciones de la célula con la variabilidad inferior de la expresión para la investigación a largo plazo es muy compleja. Una de las razones de esta complejidad es la citotoxicidad de GFP.

Además de GFP, YFP y el CFP fueron evaluados para prevenir los efectos de la toxicidad que son causados específicamente por GFP mientras que la marca estable tentativa en la deformación hepática del ASC de la rata. Las copias fluorescentes estables que expresan YFP o el CFP fueron desarrolladas mientras que era difícil desarrollar la GFP-expresión estable se esfuerzan.

CyPet y YPet

Otra variante de EYFP fue desarrollada aplicando estrategia revolucionaria de la mutagénesis a los cDNAs que codifican un par conectado de YFP-CFP. El objetivo de este revelado de la variante de EYFP era transformar YFP y el CFP simultáneamente y seleccionar los pares que han aumentado eficiencia del TRASTE. Las bibliotecas del cDNA fueron evaluadas directamente para la eficiencia del TRASTE y las mejores copias fueron descubiertas.

Estas copias fueron sujetadas al arrastramiento sintetizado de la DNA y a muchos ciclos revolucionarios de la mutagénesis al azar. Este proceso había dado lugar al revelado de CyPet-YPet (para la proteína fluorescente amarilla o color cianita para la transferencia de energía), que es un nuevo par de CFP-YFP que había mostrado el aumento cuádruple en el TRASTE radiométrico.

Una suma de siete mutaciones que empilamos en el CFP cuando la evolución dirigida se realiza para rendir CyPet. Estas mutaciones ofrecieron la emisión y la amortiguación máximas en 477 nanómetro y 435 nanómetro, respectivamente. Sin embargo, CyPet no se puede utilizar para los usos independientes pues su luminosidad es menos que cerulean. En cambio, YPet es la variante más brillante comparada a todas las variantes de YFP y exhibe estabilidad excelente de la foto.

Además, YPet tiene la resistencia más alta en un ambiente ácido comparado al resto de los derivados de YFP y por lo tanto se utiliza en las biosensor-combinaciones apuntadas en los organelos ácidos. Recientemente, se ha demostrado que las señales perfeccionadas del TRASTE habían resultado de las mutaciones de V224L y de S208F, que se pueden actuar sobre los complejos intramoleculares que se forman entre el YPet y el CyPet conectados.

Fuentes:

  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2910338/
  2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1242169/
  3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20360360
  4. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18401450
  5. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC94594/
  6. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3190146/
  7. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8777060
  8. http://pdb101.rcsb.org/motm/42
  9. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC106306/
  10. http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm
  11. http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/probes/jellyfishfps.html
  12. https://www.researchgate.net/profile/David_Miller_III/publication/12960328_Two-color_GFP_expression_system_for_C_elegans/links/0c9605187cae61aa53000000.pdf

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Last Updated: Jan 25, 2019

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