GFP-étiquetage dans la microscopie à fluorescence

Par Shelley Farrar, GCS, BSC

La protéine fluorescente verte (GFP) a été isolée la première fois dans les méduses, Aequorea Victoria. La protéine se compose de 238 résidus d'acide aminé qui produisent par fluorescence le vert une fois exposés à la lumière UV. Le gène pour le GFP a été avec succès inséré dans des bactéries d'E.coli en 1994 et le prix Nobel en chimie 2008 a été commun attribué à Osamu Shimomura, à Martin Chalfie et à Roger Y. Tsien pour la découverte et le développement des GFP.

Ils sont utilisés généralement en tant que journaliste d'expression dans la biologie. Des protéines peuvent être étiquetées avec le GFP par l'intermédiaire de la modification génétique pour qu'on observe une protéine par la microscopie à fluorescence.

Part somatosensorielle de cerveau de souris de cortex exprimant le GFP.

La microscopie à fluorescence utilise la lumière pour étudier des spécimens. On exige un appelé chimique fluorescent un fluorophore qui peut absorber la lumière des longueurs d'onde spécifiques et puis émettre la lumière de plus longues longueurs d'onde. le GFP-étiquetage est une voie de préparer un échantillon pour la microscopie à fluorescence à l'aide du GFP en tant que journaliste fluorescent de protéine.

Ceci est fait en copiant le GFP dans le bâti avec de la protéine cible au n ou aux C-terminus du réseau acide aminé.  L'utilisation du GFP-étiquetage dans la microscopie à fluorescence signifie que des protéines dans les cellules vivantes peuvent être conçues et étudiées.

La structure du GFP

Le GFP qui a été isolé la première fois dans les méduses, Aequorea Victoria, est connu comme type sauvage ou wtGFP et est le GFP le plus très utilisé. La structure du GFP comprend la structure primaire d'un réseau de 238 acides aminés, et une structure secondaire des helices hydrogène-métallisées et des feuilles plissées et un baril tertiaire ont formé la structure recouverte avec des helices.

Dans le centre est le chromophore, une partie acide aminée responsable de l'émission légère. Le GFP est particulièrement utile pour la microscopie à fluorescence car sa formation signifie que le chromophore est emballé dans la structure formée par baril, évitant des solvants et permettant à la protéine de briller par fluorescence en beaucoup de conditions. En outre, à la différence d'autres protéines qui exigent des enzymes pour se plier de composé nécessaire pour la forme exigée de protéine, ceci se produit automatiquement dans le GFP et seulement l'oxydation complémentaire du chromophore est exigée pour que la protéine brille par fluorescence.

Les types de GFP

Car le wtGFP peut absorber des longueurs d'onde multiples de la lumière il est inapproprié pour certains types de microscopie à fluorescence. D'autres GFP améliorés (eGFP) ont été découverts, développés ou produits. Une voie de développer le mutant GFP est de permettre à des colonies des bactéries avec l'expression de GFP de se développer et d'attendre des variantes de mutant de GFP pour se développer avec du temps.

La majorité de ces mutations réduisent la fluorescence mais certains se sont avérés pour augmenter la brilliance et le photostability, ainsi que changer de vitesse la crête d'excitation pour apparier les caractéristiques spectrales du filtre léger utilisé généralement dans la microscopie à fluorescence. D'autres mutations ont augmenté la signification de puissance de fluorescence qu'il y a maintenant assez de protéines fluorescentes pour couvrir presque le spectre visible de totalité.

L'utilisation du GFP-étiquetage dans la microscopie à fluorescence comprenant le transfert d'énergie de résonance de fluorescence (FRET)

Avant de GFP-étiqueter, les molécules fluorescentes utilisées dans la microscopie à fluorescence étaient souvent phototoxic, car elles ont nui aux cellules vivantes par les modifications moléculaires une fois exposées à la lumière. le GFP-étiquetage a permis aux cellules vivantes d'être illuminées sans ce type de destruction.

Utilisations à court terme de GFP-étiqueter dans la microscopie à fluorescence impliquée la protéine étant exprimée dans structures variées pour augmenter la compréhension des différences dans la morphologie cellulaire. Le potentiel in vivo de représentation pour la microscopie à fluorescence a été augmenté par l'utilisation du GFP-étiquetage, laissant pour l'observation des procédés biologiques au fil du temps.

La FRETTE est une technique qui est employée pour observer des événements en temps réel dans une cellule. Deux variantes de GFP qui répondent à différentes longueurs d'onde de la lumière par l'absorption et l'émission sont liées aux protéines. Quand les protéines sont séparées, la lumière qui excite une des variantes de GFP causera seulement une couleur d'être observée de cette protéine. Quand les protéines agissent l'un sur l'autre et la même lumière est employée, les deux variantes de GFP deviennent assez proches ensemble pour qu'il y ait un transfert d'énergie entre le fluorophore de distributeur enthousiaste et l'accepteur fluorophore.

Ceci a comme conséquence un changement de couleur à la couleur émise du deuxième GFP. Par la microscopie à fluorescence, la FRETTE peut être employée pour mesurer la distance entre deux fluorophores. Puisque la FRETTE est personne à charge de distance, cette technique a été employée pour déterminer la structure des cellules et la dynamique des interactions de protéines.

Sources :

  1. http://www.chm.bris.ac.uk/motm/GFP/GFPh.htm
  2. Yuste, R. 2005. Microscopie à fluorescence aujourd'hui. Méthodes de nature, 2, Pp. 902-904. https://www.nature.com/nmeth/journal/v2/n12/full/nmeth1205-902.html
  3. Chudakov, D. et autres 2005. Protéines fluorescentes comme ensemble d'outils pour in vivo la représentation. Tendances en biotechnologie, 23, Pp. 605-613. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16269193
  4. Hussain, S. 2012. Une introduction au transfert d'énergie de résonance de fluorescence (FRET). Tourillon de la Science de la physique, ISSN : 2276-6367. http://www.sjpub.org/sjp/abstract/sjp-268.html

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Last Updated: Feb 26, 2019

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