GFP-etichettando nella microscopia di fluorescenza

Da Shelley Farrar, MSc, BSc

La proteina fluorescente verde (GFP) in primo luogo è stata isolata dalla medusa, Aequorea Victoria. La proteina consiste di 238 residui dell'amminoacido che sono flourescente il verde una volta esposti a luce UV. Il gene per GFP è stato inserito con successo nei batteri di E.coli nel 1994 ed il premio Nobel in chimica 2008 ha ricevuto insieme a Osamu Shimomura, a Martin Chalfie ed a Roger Y. Tsien per la scoperta e lo sviluppo di GFPs.

Sono comunemente usati come reporter dell'espressione nella biologia. Le proteine possono essere etichettate con GFP via modifica genetica in modo che una proteina da osservare con microscopia di fluorescenza.

Fetta Somatosensory del cervello del mouse della corteccia che esprime GFP.

La microscopia di fluorescenza utilizza l'indicatore luminoso per studiare gli esemplari. Un prodotto chimico fluorescente chiamato un fluorophore è richiesto che può assorbire l'indicatore luminoso delle lunghezze d'onda specifiche e poi emettere l'indicatore luminoso delle lunghezze d'onda più lunghe. l'GFP-etichettatura è un modo di preparare un campione per la microscopia di fluorescenza usando il GFP come reporter fluorescente della proteina.

Ciò è fatta clonando il GFP nel telaio con la proteina bersaglio a N o all'C-estremità della catena dell'amminoacido.  L'uso di GFP-etichettatura nella microscopia di fluorescenza significa che le proteine all'interno delle celle viventi possono essere visualizzate e studiate.

La struttura di GFP

Il GFP che in primo luogo è stato isolato dalle meduse, Aequorea Victoria, è conosciuto come selvaggio tipo o wtGFP ed è il GFP più ampiamente usato. La struttura di GFP comprende la struttura primaria di una catena di 238 amminoacidi e una struttura secondaria delle eliche idrogeno-tenute da adesivo e delle lamiere sottili pieghettate e un barilotto terziario hanno modellato la struttura ricoperta con le eliche.

All'interno del centro è il cromoforo, una sezione dell'amminoacido responsabile dell'emissione di luce. GFP è particolarmente utile per microscopia di fluorescenza poichè la sua formazione significa che il cromoforo è imballato nella struttura a forma di barilotto, evitante i solventi e permettente che la proteina sia flourescente in molte circostanze. Ancora, a differenza di altre proteine che richiedono gli enzimi per l'profilatura del complesso necessario per la forma richiesta della proteina, questo si presenta automaticamente in GFP e soltanto l'ossidazione supplementare del cromoforo è richiesta affinchè la proteina sia flourescente.

I tipi di GFP

Poichè il wtGFP può assorbire le lunghezze d'onda multiple di indicatore luminoso è inadatto per determinati tipi di microscopie di fluorescenza. L'altro GFPs migliorato (eGFP) è stato scoperto, sviluppato stato o creato. Un modo di sviluppare GFPs mutante è di permettere che le colonie dei batteri con l'espressione di GFP si sviluppino ed aspettino le varianti mutanti di GFP per svilupparsi con tempo.

La maggior parte di queste mutazioni diminuisce la fluorescenza ma alcune sono state trovate per aumentare la luminosità e il photostability come pure spostare il picco di eccitazione per abbinare le caratteristiche spettrali del filtro chiaro comunemente usato nella microscopia di fluorescenza. Ulteriori mutazioni hanno aumentato il significato del rendimento della fluorescenza che ci ora sono abbastanza proteine fluorescenti per coprire quasi la gamma visibile di tutto.

L'uso di GFP-etichettatura nella microscopia di fluorescenza compreso il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET)

Prima dell'GFP-etichettatura, le molecole fluorescenti utilizzate nella microscopia di fluorescenza erano spesso phototoxic, poichè hanno nociuto alle celle viventi attraverso i cambiamenti molecolari una volta esposte ad indicatore luminoso. l'GFP-etichettatura ha permesso che le celle viventi fossero illuminate senza questo tipo di distruzione.

Gli usi a breve termine di GFP-etichettatura nella microscopia di fluorescenza hanno compreso la proteina che è espressa in varie strutture per aumentare la comprensione delle differenze nella morfologia cellulare. Il potenziale in vivo della rappresentazione per microscopia di fluorescenza è stato aumentato con l'uso di GFP-etichettatura, concedendo per l'osservazione dei trattamenti biologici col passare del tempo.

Il CERCHIO è una tecnica che è usata per osservare gli eventi in tempo reale all'interno di una cella. Due varianti di GFP che rispondono alle lunghezze d'onda differenti di indicatore luminoso con assorbimento e l'emettenza sono limitate alle proteine. Quando le proteine sono separate, l'indicatore luminoso che eccita una delle varianti di GFP indurrà soltanto un colore ad essere osservato da quella proteina. Quando le proteine interagiscono e lo stesso indicatore luminoso è usato, le due varianti di GFP diventano insieme abbastanza vicine perché ci sia un trasferimento di energia fra il fluorophore erogatore emozionante ed il ricettore fluorophore.

Ciò provoca un cambiamento di colore al colore emesso del secondo GFP. Con microscopia di fluorescenza, il CERCHIO può essere usato per quantificare la distanza fra due fluorophores. Poiché il CERCHIO è dipendente di distanza, questa tecnica è stata usata per determinare la struttura delle celle e la dinamica delle interazioni della proteina.

Sorgenti:

  1. http://www.chm.bris.ac.uk/motm/GFP/GFPh.htm
  2. Yuste, R. 2005. Microscopia di fluorescenza oggi. Metodi della natura, 2, pp. 902-904. https://www.nature.com/nmeth/journal/v2/n12/full/nmeth1205-902.html
  3. Chudakov, D. et al. 2005. Proteine fluorescenti come toolkit per in vivo rappresentazione. Tendenze relative alla biotecnologia, 23, pp. 605-613. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16269193
  4. Hussain, S. 2012. Un'introduzione al trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET). Giornale di scienza di fisica, ISSN: 2276-6367. http://www.sjpub.org/sjp/abstract/sjp-268.html

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Last Updated: Feb 26, 2019

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