GFP-colocação de etiquetas na microscopia de fluorescência

Por Shelley Farrar, CAM, BSc

A proteína fluorescente verde (GFP) foi isolada primeiramente das medusas, Aequorea victoria. A proteína consiste em 238 resíduos do ácido aminado que brilham o verde quando expor à luz UV. O gene para GFP foi introduzido com sucesso nas bactérias de E.coli em 1994 e o prémio nobel na química 2008 foi concedido comum a Osamu Shimomura, a Martin Chalfie e a Roger Y. Tsien para a descoberta e a revelação de GFPs.

São de uso geral como um repórter da expressão na biologia. As proteínas podem ser etiquetadas com o GFP através da alteração genética para que uma proteína seja observada com a microscopia de fluorescência.

Fatia Somatosensory do cérebro do rato do córtice que expressa GFP.

A microscopia de fluorescência utiliza a luz para estudar espécimes. Um produto químico fluorescente chamado um fluoróforo é exigido que possa absorver a luz de comprimentos de onda específicos e então se emitir a luz de uns comprimentos de onda mais longos. GFP-etiquetar é uma maneira de preparar uma amostra para a microscopia de fluorescência usando o GFP como um repórter fluorescente da proteína.

Isto é feito clonando o GFP no quadro com a proteína do alvo no n ou no C-término da corrente do ácido aminado.  O uso da GFP-colocação de etiquetas na microscopia de fluorescência significa que as proteínas dentro das pilhas vivas podem ser visualizadas e estudado.

A estrutura de GFP

O GFP que foi isolado primeiramente das medusa, Aequorea victoria, é sabido como o selvagem-tipo ou o wtGFP e é o GFP o mais amplamente utilizado. A estrutura de GFP inclui a estrutura preliminar de uma corrente de 238 ácidos aminados, e uma estrutura secundária de hélices hidrogênio-ligadas e de folhas plissadas e um tambor terciário deram forma à estrutura tampada com as hélices.

Dentro do centro é o cromóforo, uma secção do ácido aminado responsável para a emissão clara. GFP é particularmente útil para a microscopia de fluorescência porque sua formação significa que o cromóforo está encerrado na estrutura dada forma tambor, evitando solventes e permitindo que a proteína brilhe em muitas circunstâncias. Além disso, ao contrário de outras proteínas que exigem enzimas para o dobramento do complexo necessário para a forma exigida da proteína, isto ocorre automaticamente em GFP e somente a oxidação adicional do cromóforo é exigida para que a proteína brilhe.

Os tipos de GFP

Porque o wtGFP pode absorver comprimentos de onda múltiplos da luz é inoportuno dactilografa com certeza da microscopia de fluorescência. O outro GFPs aumentado (eGFP) foi descoberto, desenvolvido ou criado. Uma maneira de desenvolver o mutante GFPs é permitir que as colônias das bactérias com expressão de GFP cresçam e esperem variações do mutante de GFP para tornar-se com tempo.

A maioria destas mutações reduz a fluorescência mas algumas foram encontradas para aumentar o brilho e o photostability, assim como deslocar o pico da excitação para combinar as características espectrais do filtro leve de uso geral na microscopia de fluorescência. Umas mutações mais adicionais aumentaram o significado do rendimento da fluorescência que há agora bastante proteínas fluorescentes para cobrir quase o espectro visível do todo.

O uso da GFP-colocação de etiquetas na microscopia de fluorescência que inclui transferência de energia da ressonância da fluorescência (FRET)

Antes da GFP-colocação de etiquetas, as moléculas fluorescentes usadas na microscopia de fluorescência eram frequentemente phototoxic, porque prejudicaram pilhas vivas através das mudanças moleculars quando expor à luz. GFP-etiquetar permitiu que as pilhas vivas fossem iluminadas sem este tipo de destruição.

Os usos adiantados da GFP-colocação de etiquetas na microscopia de fluorescência envolveram a proteína que está sendo expressada em várias estruturas para aumentar a compreensão das diferenças na morfologia celular. O potencial da imagem lactente para a microscopia de fluorescência foi aumentado in vivo com o uso da GFP-colocação de etiquetas, reservando para a observação de processos biológicos ao longo do tempo.

A FRICÇÃO é uma técnica que seja usada para observar eventos de tempo real dentro de uma pilha. Duas variações de GFP que respondem aos comprimentos de onda diferentes da luz com a absorção e a emitância são limitadas às proteínas. Quando as proteínas são separadas, a luz que excita uma das variações de GFP fará com somente que uma cor esteja observada dessa proteína. Quando as proteínas interagem e a mesma luz está usada, as duas variações de GFP tornam-se próximas bastante junto para haver transferência de energia entre o fluoróforo fornecedor entusiasmado e o autómato fluoróforos.

Isto conduz a uma mudança da cor à cor emissora do segundo GFP. Com a microscopia de fluorescência, a FRICÇÃO pode ser usada para determinar a distância entre dois fluorophores. Porque a FRICÇÃO é dependente da distância, esta técnica foi usada para determinar a estrutura das pilhas e a dinâmica de interacções da proteína.

Fontes:

  1. http://www.chm.bris.ac.uk/motm/GFP/GFPh.htm
  2. Yuste, R. 2005. Microscopia de fluorescência hoje. Métodos da natureza, 2, pp. 902-904. https://www.nature.com/nmeth/journal/v2/n12/full/nmeth1205-902.html
  3. Chudakov, D. e outros 2005. Proteínas fluorescentes como um conjunto de ferramentas para in vivo a imagem lactente. Tendências na biotecnologia, 23, pp. 605-613. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16269193
  4. Hussain, S. 2012. Uma introdução a transferência de energia da ressonância da fluorescência (FRET). Jornal da ciência da física, ISSN: 2276-6367. http://www.sjpub.org/sjp/abstract/sjp-268.html

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Last Updated: Feb 26, 2019

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