el GFP-marcar con etiqueta en microscopia de fluorescencia

Por Shelley Farrar, MSc, BSCA

La proteína fluorescente verde (GFP) primero fue aislada de los pescados de jalea, Aequorea Victoria. La proteína consiste en 238 residuos del aminoácido que sean fluorescente verde cuando están expuestos a la luz UV. El gen para GFP fue insertado con éxito en bacterias de E.coli en 1994 y el Premio Nobel En la química 2008 fue concedido en común a Osamu Shimomura, a Martin Chalfie y a Rogelio Y. Tsien para el descubrimiento y el revelado de GFPs.

Son de uso general como reportero de la expresión en biología. Las proteínas se pueden marcar con etiqueta con GFP vía la modificación genética para que una proteína sea observada con microscopia de fluorescencia.

Rebanada somáticosensorial del cerebro del ratón de la corteza que expresa GFP.

La microscopia de fluorescencia utiliza la luz para estudiar especímenes. Una substancia química fluorescente llamada un fluoróforo se requiere que pueda absorber la luz de longitudes de onda específicas y después emitir la luz de longitudes de onda más largas. el GFP-marcar con etiqueta es una manera de preparar una muestra para la microscopia de fluorescencia usando el GFP como reportero fluorescente de la proteína.

Esto es hecha reproduciendo el GFP en marco con la proteína del objetivo en la n o el C-término de la cadena del aminoácido.  El uso de GFP-marcar con etiqueta en microscopia de fluorescencia significa que las proteínas dentro de las células vivas pueden ser visualizadas y ser estudiadas.

La estructura de GFP

El GFP que primero fue aislado de las medusas, Aequorea Victoria, se conoce como salvaje-tipo o wtGFP y es el GFP más ampliamente utilizado. La estructura de GFP incluye la estructura primaria de una cadena de 238 aminoácidos, y una estructura secundaria de hélices hidrógeno-bajo fianza y de hojas plisadas y un cañón de arma de fuego terciario dieron forma la estructura capsulada con las hélices.

Dentro del centro es el cromóforo, una sección del aminoácido responsable de la emisión liviana. GFP es determinado útil para la microscopia de fluorescencia pues su formación significa que el cromóforo está embalado en la estructura dada forma cañón de arma de fuego, evitando disolventes y permitiendo que la proteína sea fluorescente en muchas condiciones. Además, a diferencia de otras proteínas que requieran las enzimas para doblar del complejo necesario para la forma requerida de la proteína, esto ocurre automáticamente en GFP y solamente la oxidación adicional del cromóforo se requiere para que la proteína sea fluorescente.

Los tipos de GFP

Pues el wtGFP puede absorber longitudes de onda múltiples de la luz es inadecuado con certeza pulsa de microscopia de fluorescencia. Se ha descubierto, se ha desarrollado o se ha creado el otro GFPs aumentado (eGFP). Una manera de desarrollar el mutante GFPs es permitir que las colonias de bacterias con la expresión de GFP crezcan y que esperen variantes del mutante de GFP para convertirse con tiempo.

La mayoría de estas mutaciones reduce fluorescencia pero encontraron algo para aumentar luminosidad y photostability, así como para cambio el pico de la excitación para igualar las características espectrales del filtro liviano de uso general en microscopia de fluorescencia. Otras mutaciones han aumentado el significado del rendimiento de la fluorescencia que ahora hay suficiente proteínas fluorescentes para revestir casi el espectro visible del conjunto.

El uso de GFP-marcar con etiqueta en microscopia de fluorescencia incluyendo transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia (FRET)

Antes de GFP-marcar con etiqueta, las moléculas fluorescentes usadas en microscopia de fluorescencia eran a menudo phototoxic, pues dañaron las células vivas a través de cambios moleculares cuando estaban expuestas a la luz. el GFP-marcar con etiqueta permitió que las células vivas fueran iluminadas sin este tipo de destrucción.

Las aplicaciones tempranas de GFP-marcar con etiqueta en microscopia de fluorescencia implicaron la proteína que era expresada en diversas estructuras para aumentar la comprensión de las diferencias en morfología celular. El potencial in vivo de la proyección de imagen para la microscopia de fluorescencia se ha aumentado con el uso de GFP-marcar con etiqueta, permitiendo para la observación de procesos biológicos en un cierto plazo.

El TRASTE es una técnica que se utiliza para observar acciones en tiempo real dentro de una célula. Dos variantes de GFP que respondan a diversas longitudes de onda de la luz con la amortiguación y la luminosidad están limitadas a las proteínas. Cuando se separan las proteínas, la luz que excita una de las variantes de GFP hará solamente un color ser observada de esa proteína. Cuando obran recíprocamente las proteínas y se utiliza la misma luz, las dos variantes de GFP se convierten en bastante cercanas juntas para que haya una transferencia de la energía entre el fluoróforo dispensador de aceite emocionado y el aceptor fluoróforos.

Esto da lugar a un cambio del color al color emitido del segundo GFP. Con microscopia de fluorescencia, el TRASTE se puede utilizar para cuantificar la distancia entre dos fluorophores. Porque el TRASTE es dependiente de la distancia, esta técnica se ha utilizado para determinar la estructura de células y la dinámica de las acciones recíprocas de la proteína.

Fuentes:

  1. http://www.chm.bris.ac.uk/motm/GFP/GFPh.htm
  2. Yuste, R. 2005. Microscopia de fluorescencia hoy. Métodos de la naturaleza, 2, págs. 902-904. https://www.nature.com/nmeth/journal/v2/n12/full/nmeth1205-902.html
  3. Chudakov, D. y otros 2005. Proteínas fluorescentes como caja de herramientas para in vivo la proyección de imagen. Tendencias en biotecnología, 23, págs. 605-613. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16269193
  4. Hussain, S. 2012. Una introducción a la transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia (FRET). Gorrón de la ciencia de la física, ISSN: 2276-6367. http://www.sjpub.org/sjp/abstract/sjp-268.html

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Last Updated: Feb 26, 2019

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