Per analizzare i risultati sperimentali da un cytometer di flusso, è necessario da collocare “i portoni„ nei dati. Essenzialmente, questo comprende un le celle con le simili caratteristiche, quali lo spargimento leggero di andata, lo spargimento dell'indicatore luminoso laterale e l'espressione dell'indicatore.
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Prima della fissazione della strategia gating, è vitale conoscere i beni delle celle da analizzare, quale la dimensione delle cellule, l'espressione relativa degli indicatori e se i artefatti sono probabili essere introdotti prima dell'esecuzione dell'esperimento.
Esempi di gating
Spargimento di andata e laterale
Lo spargimento di andata è collegato con la dimensione della cella, mentre lo spargimento laterale è collegato con la granularità delle cellule e questo può essere usato per differenziare le vari celle e detriti. Facendo uso di questi informazioni, è possibile gate i dati di citometria a flusso in modo che sia possibile individuare i vari globuli bianchi e distinguere quelli da detriti.
Area ed altezza dello spargimento
I doppietti sono quando la citometria a flusso individua una cella, ma era in effetti due celle nella grande prossimità. Ciò può causare i problemi con l'analisi di dati, ma gating dall'altezza dello spargimento contro area dello spargimento (in genere di andata), i doppietti possono essere identificati ed essere eliminati così da ulteriore analisi.
Che cosa circa l'espressione dell'indicatore?
Gating può anche essere usato per identificare le celle che esprimono un creatore specifico. Per esempio, i linfociti, che esprimono CD3, possono essere separati da un campione di sangue in cui i globuli rossi sono stati fatti l'elettrolisi.
Queste popolazioni di CD3+ possono poi essere analizzate per ulteriori indicatori, quali CD4 e CD8, che sono indicatori a cellula T. Ancora ulteriori, le cellule T CD4/CD8 possono essere analizzate più ulteriormente per l'espressione di CD28 e di CD45RA, per differenziarsi fra naïve, l'effettore e le cellule T di memoria.
Borowitz et al., usato una strategia gating specifica per identificare le celle di leucemia dalle celle di non leucemia per usando CD45 e spargimento leggero ad angolo retto per gate la citometria a flusso. Hanno trovato che le celle di leucemia potrebbero essere identificate dai livelli intermedi di CD45 e di spargimento leggero ad angolo retto basso, come questi beni particolari sono veduti soltanto in circa 5% delle celle del midollo osseo di non leucemia.
Uno studio da Nilsson ha usato i punti gating multipli per identificare le cellule staminali ematopoietiche rare, le celle che provocano tutti i globuli.
Gating deve essere fatto manualmente?
Al giorno d'oggi, gli strumenti di software sono stati sviluppati per aiutare l'analisi dei dati di citometria a flusso. Ciò comprende il curvHDR, che è stato sviluppato da Naumann et al., che può essere usato per gating semiautomatico ed automatico per i dati di citometria a flusso.
Mentre può richiedere molto tempo analizzare manualmente i dati di citometria a flusso, facendo uso di un software può diminuire il tempo necessario. Per esempio, se molti creatori sono necessari differenziare le celle nel campione, questo può piombo ad una strategia gating più complessa in grado di possibilmente comprendere i tempi selezionati ri-gating di multiplo delle frazioni. In questo caso, un software sarebbe molto utile poichè avrebbe diminuito drammaticamente il tempo necessario per analizzare i dati.
Un altro citano ad esempio dove usando un software può essere utile è di limitare la soggettività che viene con l'analisi manuale; un software può ripiegare molto più esattamente una strategia gating di se fosse fatto manualmente, quindi questo significherebbe che i dati sarebbero stati più comparabili. Inoltre, questo sarebbe molto utile se più di una persona stesse effettuando la citometria a flusso.
Se c'è interesse nell'individuazione delle popolazioni cellulari nuove, facendo uso di un software può aiutare questo; poichè il software può contare sugli algoritmi piuttosto che una strategia gating specificata, questo potrebbe evidenziare le popolazioni novelle che possono essere mancate dal gating manuale.
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