Estratégias bloqueando para o Cytometry de fluxo

Para analisar resultados experimentais de um cytometer do fluxo, é necessário colocar “portas” nos dados. Essencialmente, isto envolve unir pilhas com as características similares, como o scatter claro dianteiro, o scatter da luz lateral e a expressão do marcador.

Pilha visualizada usando a microscopia de fluorescência - duas pilhas coladas junto têm que ser removidas usando bloquear. Por DrimaFilm

DrimaFilm | Shutterstock

Antes de ajustar uma estratégia bloqueando, é vital conhecer as propriedades das pilhas a ser analisadas, como o tamanho de pilha, a expressão relativa dos marcadores e se os produtos manufacturados são prováveis ter sido introduzidos antes de executar a experiência.

Exemplos de bloquear

Scatter dianteiro e lateral

O scatter dianteiro está relacionado ao tamanho da pilha, quando o scatter lateral for relacionado à granulosidade da pilha, e este pode ser usado para diferenciar vários pilhas e restos. Usando esta informação, é possível bloquear os dados do cytometry de fluxo de modo que seja possível detectar vários glóbulos brancos e distinguir aqueles dos restos.

Área e altura do scatter

As parelhas são quando o cytometry de fluxo detecta de uma célula, mas era de facto duas pilhas na grande proximidade. Isto pode causar problemas com análise de dados, mas bloqueando pela altura do scatter contra a área do scatter (tipicamente dianteira), as parelhas podem ser identificadas e assim removido da análise mais aprofundada.

Que sobre a expressão do marcador?

Bloquear pode igualmente ser usado para identificar as pilhas que expressam um fabricante específico. Por exemplo, os linfócitos, que expressam CD3, podem ser separados de uma amostra de sangue onde os glóbulos vermelhos lysed.

Estas populações de CD3+ podem então ser analisadas para uns marcadores mais adicionais, tais como CD4 e CD8, que são marcadores de célula T. Mesmo mais adicionais, as T-pilhas CD4/CD8 podem ser analisadas mais para a expressão de CD28 e de CD45RA, para diferenciar-se entre o naïve, o effector e as T-pilhas da memória.

Borowitz e outros, usado uma estratégia bloqueando específica para identificar pilhas da leucemia das pilhas da não-leucemia usando CD45 e luz do direito-ângulo dispersa para bloquear o cytometry de fluxo. Encontraram que as pilhas da leucemia poderiam ser identificadas por níveis intermediários de CD45 e de baixo scatter da luz do direito-ângulo, como estas propriedades particulares são consideradas somente em aproximadamente 5% de pilhas da medula da não-leucemia.

Um estudo por Nilsson usou etapas bloqueando múltiplas para identificar células estaminais hematopoietic raras, as pilhas que causam todos os glóbulos.

Bloquear tem que ser feito manualmente?

Hoje em dia, as ferramentas de software informático foram desenvolvidas para ajudar à análise de dados do cytometry de fluxo. Isto inclui o curvHDR, que foi desenvolvido por Naumann e outros, que pode ser usado para bloquear semiautomático e automático para dados do cytometry de fluxo.

Enquanto pode tomar uns muitos tempos analisar manualmente dados do cytometry de fluxo, usar um software informático pode reduzir o tempo necessário. Por exemplo, se muitos fabricantes são necessários diferenciar as pilhas na amostra, isto pode conduzir a uma estratégia bloqueando mais complexa que poderia possivelmente incluir tempos selecionados re-bloqueando do múltiplo das fracções. Neste caso, um software seria muito útil porque reduziria dramàtica o tempo necessário para analisar os dados.

Um outro exemplo onde usar um software possa ser útil é limitar a subjetividade que vem com análise manual; um software pode replicate muito mais exactamente uma estratégia bloqueando do que se foi feito manualmente, conseqüentemente este significaria que os dados seriam mais comparáveis. Também, isto seria muito útil se mais de uma pessoa realizava o cytometry de fluxo.

Se há um interesse em encontrar populações celulares novas, usar um software pode ajudar a esta; porque o software pode confiar em algoritmos um pouco do que uma estratégia bloqueando especificada, este poderia destacar as populações novas que podem ter sido faltadas bloquear manual.

Fontes

Further Reading

Last Updated: Dec 18, 2018

Dr. Maho Yokoyama

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Dr. Maho Yokoyama

Dr. Maho Yokoyama is a researcher and science writer. She was awarded her Ph.D. from the University of Bath, UK, following a thesis in the field of Microbiology, where she applied functional genomics to Staphylococcus aureus . During her doctoral studies, Maho collaborated with other academics on several papers and even published some of her own work in peer-reviewed scientific journals. She also presented her work at academic conferences around the world.

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