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Techniques de retouche de gène : ZFNs, TALENs ou CRISPR ?

Les nucleases conçus, enzymes contenant un domaine ADN-grippant de nucléotide-détail protégé par fusible à un domaine non spécifique de clivage d'ADN, sont un élément essentiel de la retouche de génome. Le produit de l'action de nucléase est une interruption visée de double-boucle d'ADN (DSB), une catégorie des dégâts d'ADN encourue par bris le sens et les brins d'ADN antisens.

DSBs stimulent des voies de réaction des dégâts d'ADN dans la cellule, y compris la jointure non-homologue de fin (NHEJ) et le réglage homologie-dirigé (HDR). Ces réactions mènent à l'altération faite sur commande, telle que des mises en place, des omissions, et des déphasages dans la séquence au site du DSB qui peut spectaculaire modifier la fonction des gènes ou le règlement.

Personnaliser le domaine ADN-grippant pour la reconnaissance visée de l'ADN en combination avec le choix rigoureux du domaine de clivage d'effecteur a comme conséquence beaucoup de souplesse d'utilisation. Le domaine effecteur peut comprendre des nucleases, des activateurs transcriptionnels et des répresseurs, des recombinases, des transposases, les méthyltransférases d'histone d'ADN, et l'acétyltransférase d'histone.

Toutes ces composantes peuvent changer le site visé d'une manière dont affecte l'expression spatio-temporelle du gène et les caractéristiques du produit de gène.

Deux telles technologies de retouche de génome basées sur le bureau d'études des nucleases de deux-domaine sont des nucleases de doigt à zinc (ZFNs) et des nucleases effecteurs comme un activateur de transcription (TALENs). Une technologie plus récente est des répétitions palindromiques courtes de réglementation groupées d'Interspaced (CRISPR) avec une protéine CRISPR-associée (Cas), un système de retouche de génome dans les bactéries, qui fonctionne différemment comparé à TALENs et à ZFNs.

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TALENs contre ZNFs

TALENs et CRISPR-Cas9 sont des endonucléases qui visent l'ADN pour le clivage d'une façon de base-détail. TALENs sont produits en protégeant par fusible le domaine obligatoire effecteur de TAL ADN (CONTE) à un domaine de clivage du domaine de la catalyse ADN de Fokl. La dimérisation de ces domaines protégés par fusible active la reconnaissance de deux moitié-sites, montrée droit de `' et ` laissé', suivi de FOK1-mediated DSB. Ceux-ci sont séparés par une séquence d'espaceur de nucléotide de longueur variable.

La spécificité obligatoire du domaine obligatoire d'ADN peut être manipulée en modifiant deux des 33-34 répétitions d'acide aminé qui composent le domaine, appelé le diresidue variable de répétition, ou RVD. La construction des domaines obligatoires hautement spécifiques d'ADN, pour cette raison, est réalisée par la combinaison plusieurs RVDs.

Ce bureau d'études du domaine obligatoire d'ADN offre un avantage par rapport à ZFNs car ZFNs dans les choix influencera la spécificité de ZFs adjacent ; pour cette raison, il est difficile déterminer la spécificité de tels choix. TALENs évite ce problème car la spécificité obligatoire d'ADN manifestée par chaque domaine de CONTE est indépendante. Des domaines de CONTE peuvent être étendus aux choix de produit qui peuvent identifier des longueurs de n'importe quelle taille.

ZNFs sont limités aux longueurs de 9-18 bps. Il offre également des effets réduits de hors circuit-objectif comparés à ZFN. Cependant, TALENs sont plus grand que ZFNs - l'ADNc codant le système est le kb ~3, relativement à la taille de ~1 kb exigée pour ZFNs. TALENS est pour cette raison exclu pour l'usage dans des applications thérapeutiques où des vecteurs viraux sont employés.

Genome Editing Techniques: ZFNs, TALENs and CRISPR

Le supérieur de CRISPR est-il à ZFN et à TALENs ?

Contrairement à ZFN et à TALENs, la reconnaissance de CRISPR est dépendante le double guidage par le crRNA et le tracrRNA, fendant 3-4 bps d'amont de la séquence de PAM plutôt qu'au site spécifique, et faute de domaine obligatoire d'ADN. Par conséquent, le guide RNAs peut être établi facilement pour viser n'importe quelle séquence.

Les systèmes de CRISPR sont faciles au l'utilisation-ce permet aux bibliothèques de la taille du génome d'être produites. Il fournit la désignation d'objectifs génomique améliorée due à la dépendance à l'égard l'appareillement de base de Watson-Torticolis de DNA-RNA, plutôt que l'interaction d'ADN-Protéine.

Il emploie beaucoup RNAs aligné par parallèle pour viser plusieurs sites simultanément et est ainsi considéré comme technique hautement précieuse. Des organismes entiers peuvent être modifiés en injectant directement l'ARN codant des machines de CRISPR dans l'embryon. L'autre option est plus complexe, exigeant le gène de cellule souche d'embryon visant par l'heure, suivie de choix et de la cultivation.

Cependant, CRISPR a une probabilité plus élevée de avoir des hors circuit-objectifs. La dépendance à l'égard un sgRNA unique, tout en étant simple, a comme conséquence une spécificité plus faible. En revanche, TALENs a un de sécurité conçu, exigeant la dimérisation de TALEN appareille pour le clivage.  

Néanmoins, la simplicité, le rendement et le coût bas de CRISPR est un avantage important par rapport à TALENS et à ZFNs. Il est important de noter que chacune des trois techniques souffre des contraintes dans la désignation d'objectifs, la spécificité imparfaite et la gène-désignation d'objectifs. Par conséquent, leur mise en place est laissée à la discrétion du chercheur basé sur l'application.

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Last Updated: Jun 28, 2019

Hidaya Aliouche

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Hidaya Aliouche

Hidaya is a science communications enthusiast who has recently graduated and is embarking on a career in the science and medical copywriting. She has a B.Sc. in Biochemistry from The University of Manchester. She is passionate about writing and is particularly interested in microbiology, immunology, and biochemistry.

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