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Gene che modifica le tecniche: ZFNs, TALENs o CRISPR?

I nucleases costruiti, enzimi che contengono un dominio nucleotide-specifico dell'DNA-associazione fuso ad un dominio non specifico di fenditura del DNA, sono una componente essenziale di modificare del genoma. Il prodotto di atto della nucleasi è una rottura mirata a del doppio filo del DNA (DSB), una categoria di danno del DNA incontrata da rottura sia il senso che fili antisenso del DNA.

DSBs stimola le vie di risposta di danno del DNA nella cella, compreso unirsi non omologo di conclusione (NHEJ) e la riparazione omologia-diretta (HDR). Queste risposte piombo alle alterazioni su ordinazione, quali le inserzioni, le eliminazioni e le alterazioni dello schema di lettura nella sequenza al sito del DSB che può alterare drammaticamente la funzione o il regolamento del gene.

Personalizzare il dominio dell'DNA-associazione per il riconoscimento mirato a di DNA congiuntamente alla selezione attenta del dominio di fenditura dell'effettore provoca moltissima versatilità. Il dominio dell'effettore può includere i nucleases, attivatori trascrizionali e repressori, recombinases, transposasi, methyltransferases dell'istone del DNA ed acetiltransferasi dell'istone.

Tutte queste componenti possono cambiare il sito mirato a in un modo che pregiudica l'espressione spazio-temporale del gene e le caratteristiche del prodotto del gene.

Due tale genoma che modifica le tecnologie basate sull'assistenza tecnica dei nucleases del due-dominio sono nucleases del dito di zinco (ZFNs) e nucleases del tipo di attivatore dell'effettore della trascrizione (TALENs). Una tecnologia più recente è brevi ripetizioni palindromiche regolarici ragruppate di Interspaced (CRISPR) insieme ad una proteina CRISPR-associata (Cas), un genoma che modifica il sistema in batteri, che le funzioni hanno confrontato diversamente a TALENs e a ZFNs.

Immagine astratta di DNA che è modificato.Necula Valentin Andrei | Shutterstock

TALENs contro ZNFs

Sia TALENs che CRISPR-Cas9 sono endonucleasi che mirano al DNA per fenditura in un modo base-specifico. TALENs è prodotto fondendo il dominio obbligatorio dell'effettore del DNA di TAL (RACCONTO) ad un dominio catalitico di fenditura del DNA del dominio di Fokl. La dimerizzazione di questi domini fusi permette al riconoscimento di due mezzo siti, designato destra del `' e ` lasciato', seguito da FOK1-mediated DSB. Questi sono separati da una sequenza del distanziatore del nucleotide della lunghezza variabile.

La specificità obbligatoria del dominio obbligatorio del DNA può essere manipolata modificando due delle 33-34 ripetizioni dell'amminoacido che compongono il dominio, chiamato la ripetizione diresidue variabile, o RVD. La costruzione dei domini obbligatori altamente specifici del DNA, quindi, è raggiunta combinandosi parecchia RVDs.

Questa assistenza tecnica del dominio obbligatorio del DNA offre un vantaggio sopra ZFNs poichè ZFNs nelle schiere influenzerà la specificità di ZFs adiacente; quindi, la specificità di tali schiere è difficile da determinare. TALENs aggira questo problema poichè la specificità obbligatoria del DNA video da ogni dominio di RACCONTO è indipendente. I domini di RACCONTO possono essere estendere alle schiere dei prodotti che possono riconoscere le lunghezze di tutta la dimensione.

ZNFs si limita alle lunghezze di 9-18 bps. Egualmente offre gli effetti diminuiti dell'fuori obiettivo confrontati a ZFN. Tuttavia, TALENs è più grande di ZFNs - il cDNA che codifica il sistema è ~3 KB, riguardante la dimensione di KB ~1 richiesta per ZFNs. TALENS quindi è precluso per uso nelle applicazioni terapeutiche dove i vettori virali sono usati.

Genome Editing Techniques: ZFNs, TALENs and CRISPR

È CRISPR superiore a ZFN e a TALENs?

Contrariamente a ZFN e a TALENs, il riconoscimento di CRISPR è dipendente l'orientamento doppio da crRNA e da tracrRNA, fendenti 3-4 bps controcorrente dalla sequenza di PAM piuttosto che al sito specifico ed in assenza di un dominio obbligatorio del DNA. Di conseguenza, la guida RNAs può essere prodotta facilmente per mirare a tutta la sequenza.

I sistemi di CRISPR sono facili al uso-questo permette alle librerie genoma di ampiezza di essere generato. Fornisce l'ottimizzazione genomica migliore dovuto la dipendenza dall'accoppiamento basso del Watson-Torcicollo di DNA-RNA, piuttosto che l'interazione della DNA-Proteina.

Usa molto RNAs stato allineato parallela per mirare simultaneamente a parecchi siti e così è considerato una tecnica altamente apprezzata. Gli interi organismi possono essere modificati direttamente iniettando il RNA che codifica il macchinario di CRISPR nell'embrione. L'opzione alternativa è più complessa, richiedendo l'individuazione dei geni della cellula staminale dell'embrione con l'ora, seguita dalla selezione e dalla coltura.

Tuttavia, CRISPR ha un'più alta probabilità di avere fuori obiettivi. La dipendenza da un singolo sgRNA, mentre è semplice, provoca la specificità più difficile. Al contrario, TALENs ha una sicurezza intrinseca costruita, richiedente la dimerizzazione di TALEN accoppia per fenditura.  

Ciò nonostante, la semplicità, il risparmio di temi ed il basso costo di CRISPR è un vantaggio significativo sopra TALENS e ZFNs. È importante notare che tutte e tre le tecniche soffrono dai vincoli nell'ottimizzazione, nella specificità imperfetta ed in individuazione dei geni. Di conseguenza, la loro entrata in vigore è lasciata a discrezione del ricercatore basato sull'applicazione.

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Last Updated: Jun 28, 2019

Hidaya Aliouche

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Hidaya Aliouche

Hidaya is a science communications enthusiast who has recently graduated and is embarking on a career in the science and medical copywriting. She has a B.Sc. in Biochemistry from The University of Manchester. She is passionate about writing and is particularly interested in microbiology, immunology, and biochemistry.

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