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Gene que edita técnicas: ZFNs, TALENs ou CRISPR?

Os nucleases projetados, enzimas que contêm um domínio ADN-obrigatório nucleotide-específico fundido a um domínio não específico da segmentação do ADN, são um componente essencial da edição do genoma. O produto da acção da nuclease é uma ruptura visada da dobro-costa do ADN (DSB), uma categoria de dano do ADN incorrida pela ruptura o sentido e costas antisentido do ADN.

DSBs estimula caminhos da resposta de dano do ADN na pilha, incluindo a junta não-homólogo do fim (NHEJ) e o reparo homologia-dirigido (HDR). Estas respostas conduzem às alterações feitas sob encomenda, tais como inserções, supressões, e frameshifts na seqüência no local do DSB que pode dramàtica alterar a função ou o regulamento do gene.

Personalizar o domínio ADN-obrigatório para o reconhecimento visado do ADN em combinação com a selecção cuidadosa do domínio da segmentação do effector conduz a muita versatilidade. O domínio do effector pode incluir nucleases, activadores transcricionais e repressors, recombinases, transposases, de histone do ADN methyltransferases, e acetyltransferase do histone.

Todos estes componentes podem mudar o local visado em uma maneira que afecte a expressão spatiotemporal do gene e as características do produto do gene.

Dois tal genoma que edita as tecnologias baseadas na engenharia de nucleases do dois-domínio são nucleases e (ZFNs) transcrição do Zinco-dedo activador-como nucleases do effector (TALENs). Uma tecnologia mais recente é repetições palíndromas curtos reguladoras aglomeradas de Interspaced (CRISPR) junto com uma proteína CRISPR-associada (Cas), um genoma que edita o sistema nas bactérias, que as funções compararam diferentemente a TALENs e a ZFNs.

Imagem abstrata do ADN que está sendo editado.Necula Valentin Andrei | Shutterstock

TALENs contra ZNFs

TALENs e CRISPR-Cas9 são os endonucleases que visam o ADN para a segmentação em uma maneira base-específica. TALENs é produzido fundindo o domínio obrigatório do effector do ADN de TAL (CONTO) a um domínio catalítico da segmentação do ADN do domínio de Fokl. O Dimerization destes domínios fundidos permite um reconhecimento de dois metade-locais, designado direito do `' e ` deixado', seguido por FOK1-mediated DSB. Estes são separados por uma seqüência do espaçador do nucleotide do comprimento variável.

A especificidade obrigatória do domínio obrigatório do ADN pode ser manipulada alterando duas das 33-34 repetições do ácido aminado que compo o domínio, chamado a repetição diresidue variável, ou RVD. A construção de domínios obrigatórios altamente específicos do ADN, conseqüentemente, é conseguida combinando diverso RVDs.

Esta engenharia do domínio obrigatório do ADN oferece uma vantagem sobre ZFNs porque ZFNs nas disposições influenciará a especificidade de ZFs adjacente; conseqüentemente, a especificidade de tais disposições é difícil de determinar. TALENs contorna este problema porque a especificidade obrigatória do ADN indicada por cada domínio do CONTO é independente. Os domínios do CONTO podem ser estendidos às disposições do produto que podem reconhecer comprimentos de todo o tamanho.

ZNFs é restringido aos comprimentos de 9-18 bps. Igualmente oferece os efeitos reduzidos do fora-alvo comparados a ZFN. Contudo, TALENs é maior do que ZFNs - o cDNA que codifica o sistema é o kb ~3, relativo ao tamanho de ~1 kb exigido para ZFNs. TALENS é impossibilitado conseqüentemente para o uso nas aplicações terapêuticas onde os vectores virais são usados.

Genome Editing Techniques: ZFNs, TALENs and CRISPR

É CRISPR superior a ZFN e a TALENs?

Em contraste com ZFN e TALENs, o reconhecimento de CRISPR é dependente a orientação dupla pelo crRNA e pelo tracrRNA, fendendo 3-4 bps a montante da seqüência do PAM um pouco do que no local específico, e na ausência de um domínio obrigatório do ADN. Conseqüentemente, o guia RNAs pode ser produzido facilmente para visar toda a seqüência.

Os sistemas de CRISPR são fáceis ao uso-este permitem bibliotecas genoma-largas de ser gerados. Fornece a escolha de objectivos genomic melhorada devido à dependência no emparelhamento baixo do Watson-Crick de DNA-RNA, um pouco do que a interacção da ADN-Proteína.

Usa muito RNAs alinhado paralela para visar simultaneamente diversos locais e é considerado assim como uma técnica altamente valiosa. Os organismos inteiros podem ser alterados directamente injetando o RNA que codifica a maquinaria de CRISPR no embrião. A opção alternativa é mais complexa, exigindo o gene da célula estaminal do embrião que visa com a hora, seguida a selecção e pelo cultivo.

Contudo, CRISPR tem uma probabilidade mais alta de ter fora-alvos. A dependência em um único sgRNA, ao ser simples, conduz a uma especificidade mais deficiente. Pelo contraste, TALENs tem um à prova de falhas projetado, exigindo o dimerization de TALEN emparelha-se para a segmentação.  

Todavia, a simplicidade, a eficiência e o baixo custo de CRISPR são uma vantagem significativa sobre TALENS e ZFNs. É importante notar que todas as três técnicas sofrem das limitações na escolha de objectivos, na especificidade imperfeita e na gene-escolha de objectivos. Conseqüentemente, sua aplicação é deixada na discreção do pesquisador baseada na aplicação.

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Last Updated: Jun 28, 2019

Hidaya Aliouche

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Hidaya Aliouche

Hidaya is a science communications enthusiast who has recently graduated and is embarking on a career in the science and medical copywriting. She has a B.Sc. in Biochemistry from The University of Manchester. She is passionate about writing and is particularly interested in microbiology, immunology, and biochemistry.

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