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Gen que corrige técnicas: ¿ZFNs, TALENs o CRISPR?

Los nucleases dirigidos, enzimas que contienen un dominio DNA-obligatorio nucleótido-específico fundido a un dominio no específico de la hendidura de la DNA, son un componente esencial de corregir del genoma. El producto de la acción de la nucleasa es un interruptor apuntado del doble-cabo de la DNA (DSB), una categoría del daño de la DNA contraída por la rotura el sentido y los cabos antisentido de la DNA.

DSBs estimula caminos de la reacción del daño de la DNA en la célula, incluyendo ensamblar no-homólogo del final (NHEJ) y la reparación homología-dirigida (HDR). Estas reacciones llevan a los cambios de encargo, tales como inserciones, supresiones, y mutágeno 'frameshift' en la serie en el sitio del DSB que puede alterar dramáticamente la función o la regla del gen.

Modificar el dominio para requisitos particulares DNA-obligatorio para el reconocimiento apuntado de la DNA conjuntamente con la selección cuidadosa del dominio de la hendidura del determinante da lugar a mucha flexibilidad. El dominio del determinante puede incluir nucleases, los activadores y los represores transcriptivos, los recombinases, las transposasas, los methyltransferases de la histona de la DNA, y acetiltransferasa de la histona.

Todos estos componentes pueden cambiar el sitio apuntado de una manera que afecte a la expresión spatiotemporal del gen y a las características del producto del gen.

Dos tal genoma que corrige las tecnologías basadas en la ingeniería de los nucleases del dos-dominio son nucleases y (ZFNs) transcripción del Cinc-dedo activador-como nucleases del determinante (TALENs). Una tecnología más reciente es repeticiones palindrómicas cortas reguladoras agrupadas de Interspaced (CRISPR) así como una proteína CRISPR-asociada (Cas), un genoma que corrige el sistema en las bacterias, que las funciones compararon diferentemente a TALENs y a ZFNs.

Imagen abstracta de la DNA que es corregida.Necula Valentin Andrei | Shutterstock

TALENs comparado con ZNFs

TALENs y CRISPR-Cas9 son los endonucleases que apuntan la DNA para la hendidura de una manera base-específica. TALENs es producido fundiendo el dominio obligatorio del determinante de la DNA de TAL (CUENTO) a un dominio catalítico de la hendidura de la DNA del dominio de Fokl. La dimerización de estos dominios fundidos habilita el reconocimiento de dos mitad-sitios, señalado la derecha del `' y ` dejado', seguido por FOK1-mediated DSB. Éstos son separados por una serie del espaciador del nucleótido del largo variable.

La especificidad obligatoria del dominio obligatorio de la DNA puede ser manipulada modificando dos de las 33-34 repeticiones del aminoácido que componen el dominio, llamado la repetición diresidue variable, o RVD. La construcción de los dominios obligatorios altamente específicos de la DNA, por lo tanto, es lograda combinando vario RVDs.

Esta ingeniería del dominio obligatorio de la DNA ofrece una ventaja sobre ZFNs pues ZFNs en matrices influenciará la especificidad de ZFs adyacente; por lo tanto, la especificidad de tales matrices es difícil de determinar. TALENs evita este problema pues la especificidad obligatoria de la DNA visualizada por cada dominio del CUENTO es independiente. Los dominios del CUENTO se pueden ampliar a las matrices de la producción que pueden reconocer largos de cualquier talla.

ZNFs se restringe a los largos de 9-18 BPS. También ofrece los efectos reducidos del lejos-objetivo comparados a ZFN. Sin embargo, TALENs es más grande que ZFNs - el cDNA que codifica el sistema es el kb ~3, en relación con la talla de ~1 kb requerida para ZFNs. TALENS por lo tanto se impide para el uso en los usos terapéuticos donde se utilizan los vectores virales.

Genome Editing Techniques: ZFNs, TALENs and CRISPR

¿Es CRISPR superior a ZFN y a TALENs?

En contraste con ZFN y TALENs, el reconocimiento de CRISPR es relacionado la dirección doble por el crRNA y el tracrRNA, hendiendo 3-4 BPS contracorriente desde la serie del PAM bastante que en el sitio específico, y en ausencia de un dominio obligatorio de la DNA. Por lo tanto, la guía RNAs se puede producir fácil para apuntar cualquier serie.

Los sistemas de CRISPR son fáciles a uso-este permiten a bibliotecas genoma-anchas ser generados. Ofrece el alcance genomic perfeccionado debido a la dependencia de emparejar bajo de la Watson-Tortícolis de DNA-RNA, bastante que la acción recíproca de la DNA-Proteína.

Utiliza mucho RNAs alineado paralelo para apuntar varios sitios simultáneamente y se mira así como técnica altamente valiosa. Los organismos enteros pueden ser modificados directamente inyectando el ARN que codifica la maquinaria de CRISPR en el embrión. La opción alternativa es más compleja, requiriendo el gen de la célula madre del embrión que apunta con la hora, seguida la selección y cultivando.

Sin embargo, CRISPR tiene una probabilidad más alta del tener lejos-objetivos. La dependencia de un único sgRNA, mientras que siendo simple, da lugar a una especificidad más pobre. Por el contrario, TALENs tiene un a prueba de averías dirigida, requiriendo la dimerización de TALEN empareja para la hendidura.  

No obstante, la simplicidad, la eficiencia y el bajo costo de CRISPR es una ventaja importante sobre TALENS y ZFNs. Es importante observar que las tres técnicas sufren de apremios en el alcance, la especificidad imperfecta y el gen-alcance. Por lo tanto, su puesta en vigor se deja a discreción del investigador basado en el uso.

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Last Updated: Jun 28, 2019

Hidaya Aliouche

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Hidaya Aliouche

Hidaya is a science communications enthusiast who has recently graduated and is embarking on a career in the science and medical copywriting. She has a B.Sc. in Biochemistry from The University of Manchester. She is passionate about writing and is particularly interested in microbiology, immunology, and biochemistry.

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