Ensaios Hematopoietic (HSC) da célula estaminal

As células estaminais hemopoiéticas (HSCs) são as mais de uso geral como uma terapia para desordens e leucemia de sangue, mas são usadas igualmente na medicina regenerativa. Como tal, identificar HSCs e determinar sua funcionalidade são uma parte importante de assegurar sua segurança nos seres humanos.

Ilustração dos glóbulos hematológicos brancos e vermelhos no córrego do sangue - por decade3ddecade3d  | Shutterstock

A derivação do grupo completo de tipos do glóbulo ocorre pelo processo de hematopoiesis. Este termo derivado de duas palavras gregas: haima (sangue) e poiēsis (para produzir algo). O processo começa a nível das células estaminais hematopoietic (HSCs) situadas na medula.

Há duas indicações fundamentais do sistema hematopoietic. O primeiro é que o sangue tem um retorno alto, necessitando a produção de glóbulos no pedido de biliões pelo dia. O segundo está aquele no adulto, todas as linhagens do sangue é derivado das células estaminais que residem na medula, que deve responder ràpida às flutuações na procura.

Como as células estaminais hematopoietic são identificadas?

A aproximação à identificação de HSC é baseada na extracção populações do candidato do `' de uma amostra de medula, seguida por um ensaio para determinar seu potencial biológico.

Os candidatos são seleccionados com base nos critérios definidos, por exemplo, a presença de marcadores característicos na superfície da pilha ou a forma e a estrutura (morfologia). A população está subdividida mais até que um subconjunto (homogéneo) puro da população esteja isolado.

Que são os tipos diferentes da pilha encontrados no sangue?

O sangue é heterogêneo, contendo uma mistura de tipos diferentes da pilha. Estas pilhas podem aproximadamente ser agrupadas em:

  • Células estaminais - caracterizadas por sua persistência in vivo (no corpo) como as pilhas a longo prazo (do LT) que persistem por > 6 meses, da auto-renovação perpétua, e pilhas (ST) a curto prazo, que persistem somente por semanas aos meses em um momento. Os últimos podem somente sustentar por um período limitado o hematopoiesis.
  • Pilhas Hematopoietic do ancestral - caracterizadas por uma capacidade limitada para a auto-renovação (multipotency). Estas pilhas são comprometidas a um caminho da diferenciação, e podem causar um número limitado de tipos da pilha.
  • Pilhas maduras - inclua os tipos inteiramente diferenciados da pilha do final do sangue.

O LT-HSCs pode auto-renovar e causar ST-HSCS, que são igualmente multipotent, mas demonstrar uma actividade mais limitada da auto-renovação. O ST-HSCs causa então os ancestral multipotent (MPPs), que são difíceis de distinguir do ST-HSCs.

O ST-HSCs causa os dois ancestral da linhagem. O primeiros são os ancestral lymphoid comuns (CLPs), que causam por sua vez pilhas de T e de B, assim como pilhas de assassino (NK) naturais.

Os ancestral mielóides comuns (CMPs) são os segundos ancestral da linhagem que geram as pilhas mielóides inteiramente diferenciadas. Estes incluem, entre outros, os glóbulos vermelhos (eritrócites), e pilhas do sistema imunitário (isto é os granulocytes, que incluem neutrófilo, e de monocytes). Os CMPs e CLPs são ancestral multipotent linhagem-específicos, e são detectados distintamente de um outro.

Como as pilhas mielóides do ancestral em uma população são detectadas in vitro?

in vitro (fora do organismo) os métodos numerosos que são usados para caracterizar e contar pilhas hematopoietic imaturas.

O ensaio da pilha (CFC) da formação de colónias para ancestral mielóides é um ensaio quantitativo e qualitativo. É geralmente empregado devido a suas velocidade e confiança. O ensaio permite alguma análise funcional das pilhas actuais. Testa a capacidade para que as pilhas formem tipos múltiplos de linhagens, que representa a capacidade diferenciar e manter a capacidade para a auto-renovação.

O ensaio é executado em media semi-contínuos na presença dos cytokines, que são exigidos para a proliferação e a maturação de todos os glóbulos. É usado para determinar ancestral com sua capacidade para formar colônias.

Da inspecção das colônias, a identificação retrospectiva do potencial biológico: isto é, multipotent contra ancestral restritos da potência (bipotent, ou unipotent, se diferenciando em dois ou no tipo de uma célula, respectivamente) da linhagem mielóide somente. As colônias de uma única pilha são formadas após 1-2 semanas em uma cultura que contem os factores de crescimento, que são substâncias que promovem a diferenciação.

As pilhas as mais imaturas são multipotent, e indicam assim o grande potencial da diferenciação. O ensaio do CFC que detecta os ancestral multipotent que podem causar diversas pilhas do sistema hematopoietic é chamado o CFU-GEMM (granulocytes, eritrócites, macrófagos, e megakaryocytes).

O tipo o mais restrito seguinte do ancestral da linhagem mielóide é os ancestral bipotent das pilhas mielóides. Estas pilhas são restringidas a dois tipos da linhagem detectados pelos CFU-granulocytes/ensaio dos macrófagos (CFU-GM).

Finalmente, os ensaios de CFU que detectam os ancestral os mais maduros, ou os mais unipotent, são a explosão-formação erythroid-restrita unidade-erythroid (BFU-E), que detectam o ancestral para pilhas erythroid, CFU--erythroid (CFU-E), megakaryocyte-restrito (CFU-MK), e granulocytes restringiu (CFU-G).

Como as pilhas lymphoid do ancestral em uma população são detectadas in vitro?

A detecção de pilhas multipotent do ancestral da linhagem lymphoid é conseguida crescendo pilhas nas pilhas de alimentador do `' que estimulam a revelação do ancestral, e nos cytokines exógenos que estimulam a diferenciação. Depois da cultura em uma camada do alimentador por 1-2 semanas, o b e as T-pilhas resultantes podem ser verificados através in vitro dos ensaios, in vivo transplantação ou por uma expansão mais adicional.

O ensaio da unidade da formação de colónias do baço (CFU-S)

Historicamente, o ensaio da unidade da formação de colónias do baço (CFU-S) foi executado, e conduzido para detectar a presença de ancestral altamente multipotent. Estes ancestral são multilineage, e podem assim diferenciar-se em pilhas das linhagens mielóides e lymphoid.

No ensaio de CFU-S, a medula é injectada em um rato irradiado (para remover suas pilhas hematopoietic endógenas) e as colônias consideradas no baço são contadas na injecção do cargo do dia 8 ou 13. Não todas as pilhas primitivas possuem a capacidade igual ao repopulate as pilhas hematopoietic retiradas. Alguns podem repopulate as pilhas por um curto período, enquanto outro podem sustentar a repopulação durante todo a vida do organismo. Esta variabilidade é denominada heterogeneidade funcional, e as pilhas repopulating são prefixadas por seu comprimento da acção: curto ou a longo prazo.

Detectando HSCs primitivo e pilhas adiantadas do ancestral

Há dois tipos in vitro de ensaios para a detecção de pilhas muito primitivas do ancestral que sobrepor com as pilhas da haste e do ancestral. Estes ensaios permitem a detecção de pilhas primitivas baseadas em sua capacidade para sustentar a produção de pilhas mielóides na presença de uma camada do alimentador de pilhas, a que são aderidos.

Ensaio deinício a longo prazo da pilha (LTC-IC)

Os ensaios de LTC-IC são baseados na capacidade de HSCs sobre pelo menos um período de 5 semanas para manter pilhas do ancestral com potencial clonogenic. Neste ensaio, as pilhas do teste são aplicadas aos pratos de cultura preparados com um aderente, camada stromal irradiada de pilhas. O media é deixado por 5 semanas.

A presença de ancestral é determinada pela substituição do media cada 1-2 semanas. Após 5 semanas as pilhas são colhidas e analisadas usando o vário CFUs. As pilhas que formam CFUs após 5 semanas representam a descendência de LTC-IC desde que CFUs actual no início se submeteria à diferenciação terminal entretanto, e assim para não ser detectáveis.

Área da pedra que forma o ensaio (CAFC) da pilha

O ensaio de CAFC é um ensaio alternativo que detecte a presença de HSCs em uma maneira visual, pela formação de áreas da pedra, que elevaram quando a camada do alimentador repopulated.

Contudo, para validar verdadeiramente in vivo esse HSCs actual em uma população, o ensaio a longo prazo da reconstituição deve ser executado. Isto reconstitui todas as linhagens do glóbulo quando transplantado em um receptor (irradiado) condicionado.

A reconstituição a longo prazo é necessária para verificar a presença de células estaminais genuínas e de ancestral multipotent. Isto é porque as pilhas hematopoietic fornecedoras do ancestral e as pilhas maduras actuais na amostra inicial da pilha podem ser detectáveis nos receptores antes da transplantação do cargo de 4 semanas. Estas ancestral multipotent ou pilhas repopulating a curto prazo podem produzir o hematopoiesis (não-sustentado) transiente por até ~4 meses de cargo-transplantação.

O prazo, hematopoiesis doador-derivado multi-linhagem deve ser detectável pelos meses >4, e este é como é possível distinguir os ancestral dos ancestral a longo prazo e o HSCs maduros, a curto prazo

Unidade repopulating competitiva (CRU)

O ensaio repopulating competitivo (CRU) da unidade é o ensaio a longo prazo da reconstituição da bandeira de ouro. É um ensaio de limitação quantitativo da diluição baseado na capacidade de HSCs para produzir a descendência mielóide e lymphoid quando transplantado em um receptor condicionado. Neste ensaio, os ratos, que foram irradiados letal, são injectados com limitação de doses de pilhas do teste, mais um número definido de pilhas de ajudante do `'.

As pilhas de ajudante funcionam como um à prova de falhas na incidência que nenhum ancestral ou HSCs a longo prazo estam presente na amostra do teste. Como tal, o ensaio oferece uma vantagem da sobrevivência dos ratos. Contudo, a população do teste deve ser distinta daquela da população do ajudante. Isto é conseguido analisando os marcadores da superfície da pilha das pilhas obtidas do sangue injecção do cargo de 16 semanas.

O SRC é uma versão alternativa do ensaio de CRU e usada para testar para o ser humano HSCs retrospectiva. Este ensaio é conceptual idêntico ao CRU, mas envolve a injecção de pilhas humanas sem sua rejeção. Os ratos devem ser immunocompromised para que este ocorra. São chamados o modelo combinado severo (SCID) do rato da imunodeficiência. As pilhas humanas podem ser identificadas basearam em marcadores humano-específicos.

Fontes

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Last Updated: Jan 7, 2019

Hidaya Aliouche

Written by

Hidaya Aliouche

Hidaya is a science communications enthusiast who has recently graduated and is embarking on a career in the science and medical copywriting. She has a B.Sc. in Biochemistry from The University of Manchester. She is passionate about writing and is particularly interested in microbiology, immunology, and biochemistry.

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