Haut-débit ADN ordonnançant des techniques

Par Shelley Farrar, GCS, BSC

De pleins génomes de plusieurs organismes ont été ordonnancés pendant les dernières quinze années, y compris le génome humain en 2004. Ces études ont été achevées utilisant Sanger ADN ordonnançant, qui a un débit limité et le coût élevé signifiant le génome humain a pris quinze ans pour ordonnancer et coûter presque trois milliards de dollars. De telles limitations ont signifié qu'il y a eu une tendance récente vers développer le haut-débit neuf ADN ordonnançant les techniques qui permettent à l'ADN d'être séquencé rapidement et à bon marché.

Il y a du haut-débit varié ADN ordonnançant des techniques mais elles concernent principalement :

  • préparation de matrice (en isolant et en épurant les fragments d'ADN originels et puis en produisant une bibliothèque d'ADN)
  • amplification clonale (formant les copies multiples en chargeant la bibliothèque sur une cellule de flux amplifiant alors les éclats dans des boîtiers)
  • ordonnancement parallèle (ordonnançant simultanément des matrices d'ADN sans condition pour la séparation matérielle)

Roche/454 pyrosequencing

Une telle application est par l'intermédiaire du pyrosequencer Roche/454, qui est un du débit élevé le plus tôt ADN ordonnançant des techniques. La méthode utilise pyrosequencing, qui tient compte de l'ordonnancer-par-synthèse pendant que la séquence donnée lecture peut être réalisée en même temps que la séquence est étendue. Par conséquent l'électrophorèse, comme utilisée dans Sanger ordonnançant, n'est pas nécessaire pour produire d'un nucléotide affiché hors de la sortie.

Pendant pyrosequencing, un nucléotide à la fois est lavé au-dessus des copies de la séquence étant déterminée, avec des nucléotides élogieux étant comportés sur la boucle de matrice. Les ajouts de nucléotide relâchent un signe léger qui peut alors trouver l'emplacement et la séquence du nucléotide étant comporté.

Image : Comment Pyrosequencing fonctionne l'illustration. ©Jacopo Pompilii, laboratoires de recherche de DensityDesign.  Plaque d'immatriculation : Attribution-partie créative de même 4,0 Internationa de terrains communaux

Tandis que ce type d'ordonnancement est plus rapide et meilleur marché que Sanger ordonnançant, il y a un problème connu des erreurs de homopolymère où il y a une difficulté en discernant une série de bases dans une séquence qui sont identiques, comme la séquence GGGG (c.-à-d. le quartet de guanine).

Analyseur de génome d'Illumina

L'analyseur de génome d'Illumina a également un concept d'ordonnancer-par-synthèse où la réaction est arrêtée après chaque base, une teinture fluorescente est employé pour afficher la marque de base et la réaction de séquence est alors prolongée avec la prochaine base.

Pendant l'amplification clonale la boucle neuve est en covalence liée à la cellule de flux. Cette boucle neuve peut courber et fixer à un oligonucléotide qui est complémentaire à la séquence d'adaptateur à l'extrémité libre de la boucle neuve. Une boucle inverse en covalence liée de seconde peut alors être synthétisée, qui est appelée une amplification de passerelle, et peut être répétée pour former des boîtiers.

Plus de 200 millions de boîtiers selon le passage peuvent être formés et 150 nucléotides peuvent être ordonnancés des deux extrémités d'un éclat. Ceci est accompli en enlevant la séquence synthétisée, répétant le cycle d'amplification de passerelle pour l'inverse de la boucle, retirant la boucle commençante et ajoutant une amorce de ordonnancement neuve pour la deuxième affichée. Ceci tient compte deux fois de la quantité de caractéristiques ordonnancées pour être produit.

Cependant, il y a un taux d'erreurs de fond élevé parce que la production de la bibliothèque et de la cellule de flux exige des opérations in vitro d'amplification. La méthode peut également inexactement déterminer des particules de charpie, de poussière et de produit chimique comme boîtiers, bien que la complexité inférieure de séquence qui est donnée droit puisse être facilement recensée.

Torrent d'ion et ordonnancement de proton d'ion

Une autre technique est le proton de torrent d'ion et d'ion ordonnançant, qui à la différence des techniques de Roche/453 et d'Illumina n'emploie pas les signes optiques pendant l'ordonnancement. Des ions de l'hydrogène+ (h) sont trouvés au lieu. Quand un deoxynucleotide est ajouté à un polymère d'ADN un ion+ de H est relâché. Ceci peut être trouvé par une diminution du pH et des changements du pH peuvent être employés pour déterminer la base ajoutée, et ainsi la séquence peut être affichée. Cette technique souffre également du problème d'erreur de homopolymère comme la technique de Roche comme parties où il est répétée sont difficile définir la même base.

Applications du haut-débit ADN ordonnançant des techniques

En 2014, on a produit un rétablissement neuf d'analyseur de génome d'Illumina qui peut efficacement des génomes humains de la séquence 45 par jour pour 1000 dollars US l'unité. Ceci signifie que le séquençage du génome pour des applications médicales et personnelles est plus près d'accessibilité.

Par l'application du haut-débit ADN ordonnançant des techniques, il est possible de recenser les variantes qui entraînent des affections génétiques. Car les technologies deviennent meilleur marché et plus efficaces, leur application deviendra de plus en plus courante et un âge neuf (ou précision) de médicament personnalisé sera produit.

Sources :

  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3831009/
  2. www.ebi.ac.uk/.../what-next-generation-dna-
  3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20486139
  4. http://www.cell.com/molecular-cell/abstract/S1097-2765(15)00340-8

[Davantage de relevé : Ordonnancement d'ADN]

Last Updated: Feb 26, 2019

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