DNA di Alto-capacità di lavorazione che ordina le tecniche

Da Shelley Farrar, MSc, BSc

I genoma completi di parecchi organismi sono stati ordinati durante i quindici anni scorsi, compreso il genoma umano nel 2004. Questi studi sono stati terminati facendo uso del DNA di Sanger che ordina, che ha una capacità di lavorazione limitata e l'alto costo che significa il genoma umano ha richiesto quindici anni per ordinare e costare quasi tre miliardo dollari. Tali limitazioni hanno significato che c'è stato una tendenza recente verso sviluppare il nuovo DNA di alto-capacità di lavorazione che ordina le tecniche che permettono che il DNA sia ordinato rapidamente ed economico.

C'è vario DNA di alto-capacità di lavorazione che ordina le tecniche ma comprendono fondamentalmente:

  • preparato del modello (through l'isolazione e la depurazione delle sequenze di DNA originali e poi creando una libreria del DNA)
  • amplificazione clonale (che forma le copie multiple caricando la libreria su una cella di flusso poi che amplia i frammenti nei cluster)
  • ordinamento parallelo (che ordina simultaneamente i modelli del DNA senza il requisito della separazione fisica)

Roche/454 che pyrosequencing

Un'tale applicazione è via il pyrosequencer Roche/454, che è uno di alto DNA di capacità di lavorazione più in anticipo che ordina le tecniche. Il metodo utilizza pyrosequencing, che tiene conto la ordinare-da-sintesi mentre la sequenza colta fuori può essere raggiunta nel momento stesso in cui la sequenza è estesa. Di conseguenza l'elettroforesi, come utilizzato in Sanger che ordina, non è necessaria generare un nucleotide colto dall'output.

Durante pyrosequencing, un nucleotide per volta è lavato sopra le copie della sequenza che è risoluta, con i nucleotidi gratuiti che sono incorporati sul filo del modello. Le aggiunte del nucleotide rilasciano un segnale luminoso che può poi individuare la posizione e la sequenza del nucleotide che è incorporato.

Immagine: Come Pyrosequencing funziona l'illustrazione. ©Jacopo Pompilii, laboratorio di ricerca di DensityDesign.  Licenza: Attribuzione-Azione creativa egualmente 4,0 Internationa dei terreni comunali

Mentre questo tipo di ordinamento è più veloce e più economico di Sanger che ordina, c'è un problema noto degli errori dell'omopolimere dove c'è una difficoltà nella distinzione dell'esecuzione delle basi su una sequenza che sono identiche, quale la sequenza GGGG (cioè il quartetto della guanina).

Analizzatore del genoma di Illumina

L'analizzatore del genoma di Illumina egualmente ha un concetto della ordinare-da-sintesi dove la reazione è interrotta dopo ogni base, una tintura fluorescente è usato per leggere il contrassegno basso e la reazione di sequenza poi è continuata con la base seguente.

Durante l'amplificazione clonale il nuovo filo in covalenza è limitato alla cella di flusso. Questo nuovo filo può piegare e fissare ad un oligonucleotide che è complementare alla sequenza del convertitore all'estremità libera di nuovo filo. Un filo inverso in covalenza limitato di secondo può poi essere sintetizzato, che è chiamato un'amplificazione del ponte e può essere ripetuto per formare i cluster.

Più di 200 milione cluster per esecuzione possono essere formati e 150 nucleotidi possono essere ordinati da entrambe le estremità di un frammento. Ciò è compiuta lavando via la sequenza sintetizzata, ripetendo il ciclo di amplificazione del ponte per l'inverso del filo, eliminante il filo cominciante ed aggiungente una nuova mano di fondo d'ordinamento per la seconda colta. Ciò tiene conto due volte la quantità di dati ordinati essere generata.

Tuttavia, c'è una tariffa di errore di alto sfondo perché la produzione della libreria e della cella di flusso richiede i punti in vitro di amplificazione. Il metodo può anche stabilire in modo errato le particelle del lint, della polvere e del prodotto chimico come cluster, sebbene la complessità bassa di sequenza che è risultata possa essere identificata facilmente.

Torrente dello ione ed ordinamento del protone dello ione

Un'altra tecnica è protone della torrente dello ione e dello ione che ordina, che a differenza delle tecniche di Illumina e di Roche/453 non usa i segnali ottici durante l'ordinamento. Idrogeno (H)+ gli ioni sono individuati invece. Quando un deoxynucleotide si aggiunge ad un polimero del DNA uno ione+ di H è rilasciato. Ciò può essere individuata con una diminuzione nel pH ed i cambiamenti nel pH possono essere usati per determinare la base aggiunta ed in modo dalla sequenza può essere letta. Questa tecnica egualmente soffre dal problema di errore dell'omopolimere come la tecnica di Roche come sezioni in cui la stessa base è ripetuta è difficile da definire.

Applicazioni del DNA di alto-capacità di lavorazione che ordinano le tecniche

Nel 2014, una nuova generazione di analizzatore del genoma di Illumina è stata creata che può efficientemente genoma umani di sequenza 45 un il giorno per 1000 dollari US Ciascuno. Ciò significa che il sequenziamento del genoma per le applicazioni mediche e personali è più vicino ad accessibilità.

Dall'applicazione del DNA di alto-capacità di lavorazione che ordina le tecniche, è possibile identificare le varianti che causano le malattie genetiche. Poichè le tecnologie diventano più economiche e più efficienti, la loro applicazione diventerà sempre più comune e una nuova età (o precisione) di medicina personale sarà creata.

Sorgenti:

  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3831009/
  2. https://www.ebi.ac.uk/training/online/course/ebi-next-generation-sequencing-practical-course/what-you-will-learn/what-next-generation-dna-
  3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20486139
  4. http://www.cell.com/molecular-cell/abstract/S1097-2765(15)00340-8

[Ulteriore lettura: Ordinamento del DNA]

Last Updated: Feb 26, 2019

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