ADN da Alto-produção que arranja em seqüência técnicas

Por Shelley Farrar, CAM, BSc

Os genomas completos de diversos organismos foram arranjados em seqüência nos quinze anos passados, incluindo o genoma humano em 2004. Estes estudos foram terminados usando o ADN de Sanger que arranja em seqüência, que tem uma produção limitada e o custo alto que significa o genoma humano tomou quinze anos para arranjar em seqüência e custar quase três bilhão dólares. Tais limitações significaram que houve uma tendência recente para desenvolver o ADN novo da alto-produção que arranja em seqüência as técnicas que permitem que o ADN seja arranjado em seqüência rapidamente e barata.

Há vário ADN da alto-produção que arranja em seqüência técnicas mas envolvem fundamental:

  • preparação do molde (com isolar e refinar os fragmentos originais do ADN e então da criação de uma biblioteca do ADN)
  • amplificação clonal (que forma cópias múltiplas carregando a biblioteca em uma pilha de fluxo que amplifica então os fragmentos em conjuntos)
  • arranjar em seqüência paralelo (que arranja em seqüência simultaneamente moldes do ADN sem a exigência para a separação física)

Roche/454 que pyrosequencing

Uma tal aplicação é através do pyrosequencer Roche/454, que é um do ADN alto o mais adiantado da produção que arranja em seqüência técnicas. O método utiliza pyrosequencing, que permite a arranjar em seqüência-por-síntese enquanto a seqüência lida para fora pode ser conseguida ao mesmo tempo que a seqüência é prolongada. Conseqüentemente a electroforese, como usado em Sanger que arranja em seqüência, não é necessário gerar um nucleotide lido fora da saída.

Durante pyrosequencing, um nucleotide de cada vez é lavado sobre cópias da seqüência que é determinada, com os nucleotides elogiosos que estão sendo incorporados na costa do molde. As adições do nucleotide liberam um sinal claro que possa então detectar o lugar e a seqüência do nucleotide que está sendo incorporado.

Imagem: Como Pyrosequencing trabalha a ilustração. ©Jacopo Pompilii, laboratório de pesquisa de DensityDesign.  Licença: Atribuição-Parte criativa igualmente 4,0 Internationa das terras comuns

Quando este tipo de arranjar em seqüência for mais rápido e mais barato do que Sanger que arranja em seqüência, há uma introdução conhecida dos erros do homopolymer onde há uma dificuldade em distinguir uma corrida das bases em uma seqüência que são idênticas, como a seqüência GGGG (isto é o quarteto da guanina).

Analisador do genoma de Illumina

O analisador do genoma de Illumina igualmente tem um conceito da arranjar em seqüência-por-síntese onde a reacção seja parada após cada base, uma tintura fluorescente é usado para ler a etiqueta baixa e a reacção da seqüência é continuada então com a base seguinte.

Durante a amplificação clonal a costa nova é limitada covalently à pilha de fluxo. Esta costa nova pode dobrar-se e anexar a um oligonucleotide que seja complementar à seqüência do adaptador na extremidade livre da costa nova. Uma costa reversa covalently limitada do segundo pode então ser sintetizada, que seja chamada uma amplificação da ponte, e pode ser repetida para formar conjuntos.

Mais de 200 milhão conjuntos pela corrida podem ser formados e 150 nucleotides podem ser arranjados em seqüência de ambas as extremidades de um fragmento. Isto é realizado lavando afastado a seqüência sintetizada, repetindo o ciclo da amplificação da ponte para o reverso da costa, removendo a costa começando e adicionando uma primeira demão arranjando em seqüência nova para a segunda lida. Isto permite duas vezes a quantidade de dados arranjados em seqüência ser gerado.

Contudo, há uma taxa de erro do fundo alto porque a produção da biblioteca e da pilha de fluxo exige in vitro etapas da amplificação. O método pode igualmente incorrectamente estabelecer partículas do fiapo, da poeira e do produto químico como conjuntos, embora a baixa complexidade da seqüência que é resultada pode facilmente ser identificada.

Torrente do íon e de protão do íon arranjar em seqüência

Uma outra técnica é o protão da torrente do íon e do íon que arranja em seqüência, que ao contrário das técnicas de Roche/453 e de Illumina não usa sinais ópticos durante arranjar em seqüência. Os íons do hidrogênio+ (h) são detectados pelo contrário. Quando um deoxynucleotide é adicionado a um polímero do ADN um íon+ de H está liberado. Isto pode ser detectado com uma diminuição no pH e as mudanças no pH podem ser usadas para determinar a base adicionada, e assim que a seqüência pode ser lida. Esta técnica igualmente sofre do problema do erro do homopolymer como a técnica de Roche como as secções onde a mesma base é repetida é difícil de definir.

Aplicações do ADN da alto-produção que arranjam em seqüência técnicas

Em 2014, uma nova geração de analisador do genoma de Illumina foi criada que pudesse eficientemente genomas humanos da seqüência 45 um o dia para 1000 dólares americanos Cada um. Isto significa que o genoma que arranja em seqüência para aplicações médicas e pessoais é mais perto da disponibilidade.

Pela aplicação do ADN da alto-produção que arranja em seqüência técnicas, é possível identificar as variações que causam desordens genéticas. Porque as tecnologias se tornam mais baratas e mais eficientes, sua aplicação tornar-se-á cada vez mais comum e uma idade nova (ou precisão) da medicina personalizada será criada.

Fontes:

  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3831009/
  2. https://www.ebi.ac.uk/training/online/course/ebi-next-generation-sequencing-practical-course/what-you-will-learn/what-next-generation-dna-
  3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20486139
  4. http://www.cell.com/molecular-cell/abstract/S1097-2765(15)00340-8

[Leitura adicional: Arranjar em seqüência do ADN]

Last Updated: Feb 26, 2019

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