DNA de la Alto-producción que ordena técnicas

Por Shelley Farrar, MSc, BSCA

Los genomas completos de varios organismos se han ordenado en los últimos quince años, incluyendo el genoma humano en 2004. Estos estudios fueron terminados usando la DNA de Sanger que ordenaba, que tiene una producción limitada y el alto costo que significaba el genoma humano tardó quince años para ordenar y para costar casi tres mil millones dólares. Tales limitaciones han significado que ha habido una tendencia reciente hacia desarrollar la nueva DNA de la alto-producción que ordenaba las técnicas que permiten que la DNA sea ordenada rápidamente y barato.

Hay diversa DNA de la alto-producción que ordena técnicas pero implican fundamental:

  • preparación del patrón (con el aislamiento y la purificación de los fragmentos originales de la DNA y después crear una biblioteca de la DNA)
  • amplificación clónica (que forma copias múltiples cargando la biblioteca sobre una célula de flujo entonces que amplifica los fragmentos en atados)
  • secuencia paralela (que ordena simultáneamente patrones de la DNA sin el requisito para la separación física)

Roche/454 pyrosequencing

Un tal uso está vía el pyrosequencer Roche/454, que es uno de la alta DNA más temprana de la producción que ordena técnicas. El método utiliza pyrosequencing, que permite ordenar-por-síntesis mientras que la serie leída puede ser lograda al mismo tiempo que la serie es extendida. Por lo tanto la electroforesis, como se utiliza en Sanger que ordena, no es necesaria generar un nucleótido leído fuera del rendimiento.

Durante pyrosequencing, un nucleótido al mismo tiempo se lava sobre las copias de la serie que es resuelta, con los nucleótidos elogiosos que son incorporados sobre el cabo del patrón. Las adiciones del nucleótido liberan una señal liviana que pueda entonces descubrir la situación y la serie del nucleótido que es incorporado.

Imagen: Cómo Pyrosequencing trabaja el ejemplo. ©Jacopo Pompilii, laboratorio de investigación de DensityDesign.  Licencia: Atribución-Parte creativa igualmente 4,0 Internationa de los campos comunes

Mientras que este tipo de secuencia es más rápido y más barato que Sanger que ordena, hay una aplicación sabida los desvíos del homopolímero donde hay una dificultad en la distinción de una corrida de las bases en una serie que son idénticas, por ejemplo la serie GGGG (es decir el cuarteto de la guanina).

Analizador del genoma de Illumina

El analizador del genoma de Illumina también tiene un concepto de la ordenar-por-síntesis donde la reacción se para después de cada base, un tinte fluorescente se utiliza para leer la escritura de la etiqueta baja y la reacción de la serie entonces se continúa con la base siguiente.

Durante la amplificación clónica el nuevo cabo covalente está limitado a la célula de flujo. Este nuevo cabo puede doblar y sujetar a un oligonucleótido que sea complementario a la serie del adaptador en el extremo libre del nuevo cabo. Un cabo reverso covalente limitado del segundo se puede entonces sintetizar, que se llama una amplificación del puente, y se puede relanzar para formar atados.

Más de 200 millones de atados por corrida pueden ser formados y 150 nucleótidos se pueden ordenar de ambos extremos de un fragmento. Esto es lograda quitando la serie sintetizada, relanzando el ciclo de la amplificación del puente para la marcha atrás del cabo, quitando el cabo que comienza y agregando una nueva pintura de fondo de secuencia para la segunda leída. Esto permite dos veces la cantidad de datos ordenados ser generada.

Sin embargo, hay una tasa de error del alto fondo porque la producción de la biblioteca y de la célula de flujo requiere pasos ines vitro de la amplificación. El método puede también establecer incorrectamente partículas de la pelusa, del polvo y de la substancia química como atados, aunque la complejidad inferior de la serie se resulta que puede ser determinada fácilmente.

Torrente del ión y secuencia del protón del ión

Otra técnica es el protón del torrente del ión y del ión que ordena, que a diferencia de técnicas de Roche/453 y de Illumina no utiliza señales ópticas durante la secuencia. Los iones del hidrógeno+ (h) se descubren en lugar de otro. Cuando un deoxynucleotide se agrega a un polímero de la DNA se libera+ un ión de H. Esto se puede descubrir con una disminución del pH y los cambios en el pH se pueden utilizar para determinar la base adicional, y así que la serie puede ser leída. Esta técnica también sufre del problema del desvío del homopolímero como la técnica de Roche como secciones donde se relanza la misma base es difícil de definir.

Usos de la DNA de la alto-producción que ordenan técnicas

En 2014, una nueva generación de analizador del genoma de Illumina fue creada que puede eficientemente los genomas humanos de la serie 45 al día para 1000 dólares de EE. UU. por cada uno. Esto significa que el genoma que ordena para los usos médicos y personales está más cercano a asequibilidad.

Por el uso de la DNA de la alto-producción que ordena técnicas, es posible determinar las variantes que causan desordenes genéticos. Pues las tecnologías llegan a ser más baratas y más eficientes, su uso llegará a ser cada vez más común y una nueva edad (o precisión) del remedio personalizado será creada.

Fuentes:

  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3831009/
  2. https://www.ebi.ac.uk/training/online/course/ebi-next-generation-sequencing-practical-course/what-you-will-learn/what-next-generation-dna-
  3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20486139
  4. http://www.cell.com/molecular-cell/abstract/S1097-2765(15)00340-8

[Lectura adicional: Secuencia de la DNA]

Last Updated: Feb 26, 2019

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