Comment CRISPR compare-t-il à d'autres techniques de Gène-Retouche ?

les techniques de Gène-retouche basées sur des nucleases et des facteurs synthétiques de transcription ont activé la modification visée de la séquence du gène et de l'expression. Elles ont été employées à l'ajout directement visé de gène pour des buts thérapeutiques, assomment des gènes liés aux maladies et rectifient des mutations pathogènes.

Actuel il y a quatre classes importantes des nucleases conçus utilisés pour la retouche de génome : les nucleases de doigt à zinc (ZFN), nucleases effecteurs comme un activateur de transcription (TALENs), ont conçu les meganucleases dérivés des éléments génétiques mobiles d'origine microbienne, et le système de CRISPR avec de l'endonucléase Cas9 ARN-guidée.

Comparaison avec d'autres techniques

ZFN sont les plus vieux et plus déterminé des protéines ADN-grippantes conçues mentionnées ci-dessus, le plus habituellement basé sur l'enzyme de restriction de FokI protégée par fusible à un domaine ADN-grippant de doigt à zinc conçu pour viser une séquence d'ADN spécifique. Les méthodes multiples sont à la disposition des chercheurs pour sélecter et concevoir ZFN visé aux sites nouveaux et désirés.

TALENs sont des protéines naturelles dérivées du genre bactérien Xanthomonas qui sont assimilées à ZFNs, car l'activité est de nouveau par le FokI. Chaque domaine ADN-grippant peut identifier une base différente et unique d'ADN, ainsi une combinaison de TALENs différent peut (dans la pratique) soit employée pour viser n'importe quelle séquence spécifique sur le génome.

ZFN et TALENs sont des protéines modulaires qui agissent l'un sur l'autre avec l'incision principale de la structure de double helice de l'ADN afin d'identifier les paires de bases spécifiques. Chaque module de doigt à zinc grippe avec un triplet de nucléotide, alors que les sous-unités de TALEN agissent l'un sur l'autre avec de seules paires de bases. Nous avons ZFN procurable pour viser pratiquement tous les triplets possibles de nucléotide, quoique les différents doigts à zinc peuvent manifester des effets contexte-dépendants.

Meganucleases des micros-organismes ont des séquences naturellement longues de reconnaissance (plus en grande partie que 14 paires de bases), et des variantes variées de meganuclease ont été produites par le bureau d'études de protéine pour couvrir une myriade de seules combinaisons de séquence. D'ailleurs, des meganucleases ont été montrés pour entraîner moins de toxicité en cellules si comparés à ZFN et à TALENs.

Le dernier développement dans ce type de technologie est le système CRISPR/Cas9, qui sont les mécanismes de défense basés sur ARNs des bactéries et des archéobactéries qui recensent et éliminent l'étranger ADN des bactériophages et des plasmides de attaque. Une de leurs principales caractéristiques est l'endonucléase Cas9 visant pour fendre une séquence d'objectif utilisant l'ARN d'un guide (diminué comme gRNA).

Spécificités de la désignation d'objectifs d'ADN ARN-guidée par CRISPR/Cas

Dans le système de CRISPR, la protéine Cas9 mentionnée ci-dessus est orientée sur le site d'objectif utilisant le gRNA, qui se compose d'un protospacer de 20 paires de bases qui fixe à la boucle complémentaire de la séquence d'objectif, ainsi qu'une région continuelle agissant l'un sur l'autre avec la protéine Cas9.

La séquence d'objectif doit être promptement suivie d'un motif protospacer-adjacent (habituellement diminué comme PAM) pour la reconnaissance par la protéine Cas9. Ainsi l'ADN efficace visant par CRISPR/Cas9 est accompli en choisissant un protospacer qui est complémentaire à la séquence génomique appropriée.

Pendant que la spécificité est dictée par la complémentarité d'ADN (sans besoin de bureau d'études multipas de protéine), la technologie de CRISPR/Cas a écrit l'illustration en tant que plus rapide, une voie plus droite et plus abordable pour la génome-retouche par rapport aux approches traditionnelles de ZFN et de TALENs.

En outre, les systèmes basés sur Cas9 ont montré la propension de viser des séquences d'hétérochromatine, visant l'emplacement DNase-inaccessible et se fendant aux régions fortement méthylées ; ce fait (en plus de la souplesse offerte par des variantes multiples de Cas9 pour le choix des objectifs) prête cette souplesse d'utilisation phénoménale d'approche pour le bureau d'études de génome.

Sources

  1. http://www.jci.org/articles/view/72992
  2. http://embomolmed.embopress.org/content/7/4/363
  3. http://genesdev.cshlp.org/content/28/17/1859.full
  4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4343198/
  5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3694601/
  6. http://www.cell.com/trends/biotechnology/pdf/S0167-7799(13)00087-5.pdf
  7. Thakore pi, bureau d'études de génome de Gersbach CA pour des applications thérapeutiques. Dans : Laurence J, Franklin M, éditeurs. Traduction de la thérapie génique à la clinique : Techniques et approches. Édition académique, Elsevier, 2015 ; Pp. 27-44.

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Last Updated: Aug 23, 2018

Dr. Tomislav Meštrović

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Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

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