Come CRISPR confronta ad altre tecniche Gene-Modificare?

Gene-modificando le tecniche basate sui nucleases e sui fattori di trascrizione sintetici hanno permesso alla modifica mirata a della sequenza e dell'espressione del gene. Sono state usate all'aggiunta direttamente mirata a del gene per gli scopi terapeutici, tramortono i geni connessi con le malattie e correggono le mutazioni patogene.

Corrente ci sono quattro classi importanti di nucleases costruiti impiegati per il genoma che modificano gli scopi: i nucleases del dito di zinco (ZFN), nucleases del tipo di attivatore dell'effettore della trascrizione (TALENs), hanno costruito i meganucleases derivati dagli elementi genetici mobili dell'origine microbica ed il sistema di CRISPR con l'endonucleasi RNA-guida Cas9.

Confronto con altre tecniche

ZFN sono il più vecchio e più stabilito delle proteine costruite suddette dell'DNA-associazione, il abituale basato sull'enzima della restrizione di FokI fuso ad un dominio dell'DNA-associazione del dito di zinco costruito per mirare ad una sequenza specifica del DNA. I metodi multipli sono a disposizione dei ricercatori per selezionare e la progettazione dello ZFN mirato a ai nuovi e siti desiderati.

TALENs è proteine naturali derivate dal genere batterico Xanthomonas che sono simili a ZFNs, poichè l'attività è ancora con il FokI. Ogni dominio dell'DNA-associazione può riconoscere una base differente e singola del DNA, così una combinazione di TALENs differente può (in pratica) è usata per mirare a tutta la sequenza specifica sul genoma.

Sia ZFN che TALENs sono proteine modulari che interagiscono con la scanalatura principale della struttura di doppia elica di DNA per riconoscere le coppie di basi specifiche. Ogni modulo del dito di zinco lega con un tripletto del nucleotide, mentre gli sottounità di TALEN interagiscono con le singole coppie di basi. Abbiamo ZFN disponibile mirare a praticamente tutti i tripletti possibili del nucleotide, anche se i diversi dito di zinca possono video gli effetti contesto-dipendenti.

Meganucleases dei microrganismi ha sequenze naturalmente lunghe del riconoscimento (più in gran parte di 14 coppie di basi) e le varie varianti di meganuclease sono state generate da assistenza tecnica della proteina per riguardare una miriade delle combinazioni uniche di sequenza. Inoltre, i meganucleases sono stati indicati per causare la meno tossicità in celle una volta confrontati a ZFN e a TALENs.

L'ultimo sviluppo in questo tipo di tecnologia è il sistema CRISPR/Cas9, che sono a meccanismi di difesa basati a RNA dei batteri e del archaea che identificano ed eliminano il DNA dello straniero dai batteriofagi e dai plasmidi d'attacco. Una delle loro funzionalità principali è endonucleasi Cas9 mirante per fendere una sequenza dell'obiettivo facendo uso di un RNA della guida (accorciato come gRNA).

Specificità di ottimizzazione del DNA RNA-guida CRISPR/Cas

Nel sistema di CRISPR, la proteina suddetta Cas9 è orientata verso il sito dell'obiettivo facendo uso di gRNA, che consiste di un protospacer di 20 coppie di basi che fissa al filo complementare della sequenza dell'obiettivo come pure di una regione costante che interagisce con la proteina Cas9.

La sequenza dell'obiettivo deve essere seguita subito da un motivo protospacer-adiacente (accorciato solitamente come PAM) per il riconoscimento da proteina Cas9. Così l'efficace DNA che mira da CRISPR/Cas9 è compiuto scegliendo un protospacer che è complementare alla sequenza genomica pertinente.

Mentre la specificità è dettata dalla complementarità del DNA (senza l'esigenza di assistenza tecnica a più gradi della proteina), la tecnologia di CRISPR/Cas ha fornito la maschera come il più veloce, modo più diretto e più accessibile per genoma-modificare rispetto agli approcci tradizionali di TALENs e di ZFN.

Ancora, i sistemi basati su Cas9 hanno indicato la tendenza a mirare alle sequenze dell'eterocromatina, miranti alle posizioni Dnasi-inaccessibili e fendentesi alle regioni altamente metilate; questo fatto (oltre alla flessibilità offerta dalle varianti multiple di Cas9 per la selezione degli obiettivi) presta questa versatilità fenomenale di approccio per assistenza tecnica del genoma.

Sorgenti

  1. http://www.jci.org/articles/view/72992
  2. http://embomolmed.embopress.org/content/7/4/363
  3. http://genesdev.cshlp.org/content/28/17/1859.full
  4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4343198/
  5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3694601/
  6. http://www.cell.com/trends/biotechnology/pdf/S0167-7799(13)00087-5.pdf
  7. Thakore pi, assistenza tecnica del genoma di Gersbach CA per le applicazioni terapeutiche. In: Laurence J, Franklin m., editori. Traduzione della terapia genica alla clinica: Tecniche e approcci. Edizione accademica, Elsevier, 2015; pp. 27-44.

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Last Updated: Aug 23, 2018

Dr. Tomislav Meštrović

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Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

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