Como CRISPR compara a outras técnicas deEdição?

Gene-editando as técnicas baseadas em nucleases e em factores sintéticos da transcrição permitiram a alteração visada da seqüência e da expressão do gene. Foram usados à adição directamente visada do gene para finalidades terapêuticas, batem para fora os genes associados com as doenças e corrigem mutações patogénicos.

Actualmente há quatro classes principais de nucleases projetados empregados para o genoma que editam finalidades: zinque nucleases do dedo (ZFN), transcrição activador-como nucleases do effector (TALENs), os meganucleases projetados derivados dos elementos genéticos móveis da origem microbiana, e o sistema de CRISPR com o endonuclease Cas9 RNA-guiado.

Comparação com outras técnicas

ZFN são os mais velhos e estabelecido mais das proteínas ADN-obrigatórias projetadas acima mencionadas, baseado o mais habitualmente na enzima da limitação de FokI fundida a um domínio ADN-obrigatório do dedo do zinco projetado para visar uma seqüência específica do ADN. Os métodos múltiplos estão disponíveis aos pesquisadores para selecionar e projetar ZFN visado aos locais novos e desejados.

TALENs é as proteínas naturais derivadas do género bacteriano Xanthomonas que são similares a ZFNs, porque a actividade é outra vez com o FokI. Cada domínio ADN-obrigatório pode reconhecer uma base diferente, única do ADN, assim uma combinação de TALENs diferente pode (na prática) seja usada para visar toda a seqüência específica no genoma.

ZFN e TALENs são as proteínas modulares que interagem com o sulco principal da estrutura de hélice dobro do ADN a fim reconhecer pares baixos específicos. Cada módulo do dedo do zinco liga com uma objectiva tripla do nucleotide, visto que as subunidades de TALEN interagem com os únicos pares baixos. Nós temos ZFN disponível para visar praticamente todas as objectivas triplas possíveis do nucleotide, embora os dedos individuais do zinco podem indicar efeitos contexto-dependentes.

Meganucleases dos micro-organismos tem seqüências naturalmente longas do reconhecimento (maior de 14 pares baixos), e as várias variações do meganuclease foram geradas pela engenharia da proteína para cobrir uma miríade de combinações originais da seqüência. Além disso, os meganucleases foram mostrados para causar menos toxicidade nas pilhas quando comparados a ZFN e a TALENs.

A revelação a mais atrasada neste tipo de tecnologia é o sistema CRISPR/Cas9, que são mecanismos de defesa RNA-baseados das bactérias e do archaea que identificam e eliminam o ADN do estrangeiro dos bacteriófagos e dos plasmídeo de ataque. Uma de suas características principais é o endonuclease Cas9 apontado fender uma seqüência do alvo usando um RNA do guia (encurtado como o gRNA).

Especificidades da escolha de objectivos RNA-guiada CRISPR/Cas do ADN

No sistema de CRISPR, a proteína Cas9 acima mencionada é dirigida para o local do alvo usando o gRNA, que consiste em um protospacer baixo de 20 pares que anexe à costa complementar da seqüência do alvo, assim como uma região constante que interage com a proteína Cas9.

A seqüência do alvo deve prontamente ser seguida por um motivo protospacer-adjacente (encurtado geralmente como o PAM) para o reconhecimento pela proteína Cas9. Assim o ADN eficaz que visa por CRISPR/Cas9 é realizado escolhendo um protospacer que seja complementar à seqüência genomic relevante.

Enquanto a especificidade está ditada pela complementaridade do ADN (sem a necessidade para a engenharia multistep da proteína), a tecnologia de CRISPR/Cas incorporou a imagem como o mais rápido, uma maneira mais directa e mais disponível para genoma-editar em comparação com aproximações tradicionais de ZFN e de TALENs.

Além disso, os sistemas baseados em Cas9 mostraram a propensão visar as seqüências do heterochromatin, visando lugar DNase-inacessíveis e fendendo-se em regiões altamente misturadas; este facto (além do que a flexibilidade oferecida por variações múltiplas de Cas9 para a selecção dos alvos) empresta esta versatilidade fenomenal da aproximação para a engenharia do genoma.

Fontes

  1. http://www.jci.org/articles/view/72992
  2. http://embomolmed.embopress.org/content/7/4/363
  3. http://genesdev.cshlp.org/content/28/17/1859.full
  4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4343198/
  5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3694601/
  6. http://www.cell.com/trends/biotechnology/pdf/S0167-7799(13)00087-5.pdf
  7. PI de Thakore, engenharia do genoma de Gersbach CA para aplicações terapêuticas. Em: Laurence J, Franklin M, editores. Traduzindo a terapia genética à clínica: Técnicas e aproximações. Imprensa académica, Elsevier, 2015; pp. 27-44.

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Last Updated: Aug 23, 2018

Dr. Tomislav Meštrović

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Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

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