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Come la cromatografia di scambio ionico funziona?

La cromatografia (IEX) di scambio ionico è una tecnica che è comunemente usata nella depurazione della biomolecola. Comprende la separazione di molecole in base alla loro tassa.

Questa tecnica sfrutta l'interazione fra le molecole fatte pagare in un campione e le parti in modo opposto fatte pagare nella fase della cancelleria della matrice della cromatografia. Questo tipo di separazione è difficile facendo uso di altre tecniche poichè la tassa è manipolata facilmente dal pH del buffer usato.

Due tipi di separazioni di scambio ionico è possibili - scambio cationico e scambio anionico.  Nello scambio anionico la fase stazionaria - fatto pagare mentre nello scambio cationico è negativamente - è fatta pagare positivamente.

Principio di cromatografia di scambio ionico

La cromatografia di IEX è utilizzata nella separazione di biomolecole fatte pagare. Il campione grezzo che contiene le molecole fatte pagare è usato come la fase liquida. Quando attraversa la colonna cromatografica, le molecole legano ai siti in modo opposto fatti pagare nella fase stazionaria.

Le molecole separate in base alla loro tassa sono eluite facendo uso di una soluzione di variazione della forza ionica. Passando una tal soluzione attraverso la colonna, la separazione altamente selettiva di molecole secondo le loro spese differenti ha luogo.

La tecnica

I punti chiave nella procedura di scambio ionico della cromatografia sono elencati qui sotto:

  • Un campione impuro della proteina è caricato nella colonna di cromatografia di scambio ionico ad un pH particolare.
  • Le proteine fatte pagare legheranno ai gruppi funzionali in modo opposto fatti pagare nella resina
  • Un gradiente del sale è usato per eluire le proteine separate. Alle concentrazioni a bassa percentuale di sale, le proteine che hanno pochi gruppi fatti pagare sono eluite ed alle più alte concentrazioni nel sale, le proteine con parecchi gruppi fatti pagare sono eluite.
  • Le proteine e le impurità indesiderate sono eliminate lavando la colonna.

Un gradiente di pH può anche applicarsi per eluire le diverse proteine in base al loro punto isoelettrico (pI) cioè il punto a cui gli amminoacidi in una proteina portano la tassa neutrale e quindi non migra in un campo elettrico. Poichè gli amminoacidi sono composti ionici dello zwitter contengono i gruppi che hanno sia cariche positive che negative. Sulla base del pH dell'ambiente, le proteine portano una carica positiva, negativa, o di zero. Al loro punto isoelettrico, non interagiranno con le parti fatte pagare nella resina della colonna e quindi non sono eluiti. Un gradiente diminuente di pH può essere usato per eluire le proteine facendo uso di una resina di scambio anionico e un gradiente aumentante di pH può essere usato per eluire le proteine dalle resine di scambio cationico. Ciò è perché aumentando il buffer pH della fase mobile induce la proteina ad essere più di meno protonated (di meno positivamente - fatto pagare) in modo da non può formare negativamente un'interazione ionica con - resina fatta pagare, concedente è l'eluizione. Per contro, abbassare il pH della fase mobile indurrà la molecola ad essere protonated (di meno negativamente charged_, permettendo la sua eluizione.

Selezione della resina in cromatografia di scambio ionico

Le resine di scambio ionico hanno positivamente o negativamente - gruppi funzionali fatti pagare in covalenza collegati ad una matrice solida. Le matrici sono fatte solitamente di cellulosa, del polistirolo, dell'agarosi e del poliacrilammide. Alcuni dei fattori che pregiudicano la scelta della resina sono anione o scambiatore cationico, portata, scambiatore di ioni debole o forte, dimensione delle particelle della resina e la capacità obbligatoria. La stabilità della proteina di interesse detta la selezione di un anione o di uno scambiatore cationico - qualsiasi scambiatore può essere usato se la stabilità è di nessuna preoccupazione.

Le applicazioni di cromatografia di scambio ionico

Lo scambio ionico è il metodo cromatografico più ampiamente usato per la separazione e la depurazione di biomolecole fatte pagare quali i polipeptidi, le proteine, i polinucleotidi e gli acidi nucleici. La sua applicabilità diffusa, capacità elevata e semplicità e l'sua alta risoluzione sono le ragioni chiave per il suo successo come metodo di separazione. La cromatografia di scambio ionico è ampiamente usata in parecchie applicazioni industriali alcune di cui sono come segue:

  • Separazione e depurazione di componenti del sangue quali albumina, i fattori di crescita recombinanti e gli enzimi.
  • Biotecnologia - applicazioni analitiche quali controllo di qualità ed il video trattato
  • Alimento e ricerca clinica - studiare le varietà del grano e la correlazione di proteinuria con differenti malattie renali.
  • Fermentazione - le resine di scambio cationico sono usate per riflettere il trattamento di fermentazione durante la produzione della ß-galattosidasi.

Riferimenti

Further Reading

Last Updated: Aug 23, 2018

Susha Cheriyedath

Written by

Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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