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Comment l'ordonnancement entier de bisulfite de génome fonctionne-t-il ?

Les progrès récents en ordonnançant des techniques ont permis au séquençage du génome entier de devenir plus courant et plus vite. L'ordonnancement entier de bisulfite de génome (WGBS) est un tel prochain rétablissement ordonnançant la technique qui permet à des usagers d'analyser la méthylation d'ADN à la définition de base unique.

La méthylation d'ADN est un mécanisme épigénétique qui règle l'expression du gène et a des applications dans plusieurs domaines biologiques, tels que les maladies et le cancer.

Le scientifique analyse le gel d
Le scientifique analyse le gel d'ADN utilisé en génétique, médecines légales, découverte de médicaments, biologie et médicament. Crédit d'image : Gopixa/Shutterstock

Méthodologie

La méthylation est critique à plusieurs rôles biologiques et a un rôle dans certaines conditions de la maladie. L'expression du gène est réglée par méthylation d'ADN en recrutant des protéines ou en empêchant gripper des facteurs de transcription à l'ADN. Elle se produit pendant le développement, où elle aide à régler la transcription de tissu-détail pendant que les cellules différencient.

WGBS combine la conversion de bisulfide de sodium de la séquence avec l'ordonnancement élevé du débit ADN. La réaction de bisulfite de sodium protège des methylcytosines contre la conversion, alors que des cytosines unmethylated sont convertis en uracile. Après ACP, ils sont convertis en thymines, alors que les cytosines méthylés apparaîtront comme cytosines. Methylcytosines sont les versions méthylées des bases de cytosine. Ceci est fait en transférant un groupe méthylique sur la position C5 de la cytosine.

Bisulfite Sequencing

Le génotypage unique de polymorphisme (SNP) de nucléotide ou l'ordonnancement de prochain rétablissement est employé souvent pour l'interrogation de la méthylation d'ADN de différents sites de CpG. Les sites de CpG sont cytosine et guanine qui sont séparés par un groupe de phosphate, et sont connus comme sites de CG. Le methylome humain contient environ 28 millions de sites de CG. chez l'homme. Il y a également les sites méthylés parCG. : CHG ou CHH, où H représente l'adénine, les thymines, ou la cytosine.

Des bibliothèques génomiques peuvent être construites après conversion de bisulfite. Une des premières expériences utilisant WGBS a constaté qu'après filtrage pour assurer l'exactitude dans leur bibliothèque génomique, ils ont couvert environ 93% de tous les cytosines qui pourraient théoriquement être couverts. C'était assimilé à la couverture classique vue dans une expérience de bisulfite-ordonnancement conventionnelle pour un lieu unique.

Cependant, le bisulfite converti ordonnançant les bibliothèques montrent la diversité très inférieure parce que les bases qui apparaissent sont principalement adénine, guanine, et thymines, avec une fraction très petite des cytosines. C'est parce que les cytosines qui apparaissent sont seulement les cytosines méthylés, alors que les cytosines unmethylated ont été convertis en thymines.

L'ordonnancement du génome entier est généralement tout à fait cher. Par conséquent, bien qu'il ait été appliqué à de grands génomes tels que le génome humain, un grand nombre de différents échantillons sont rarement ordonnancés. L'ordonnancement réduit de bisulfite de représentation (RRBS) a été développé pour ceci, dans lequel la réaction de bisulfite se produit mais l'ordonnancement est limité environ à 1% du génome. Ceci active l'ordonnancement du génome de plusieurs personnes.

Éditions avec la méthodologie courante

On l'a découvert qu'une polarisation de teneur de CHROMATOGRAPHIE GAZEUSE dans l'amplification des fragments d'ADN pour le débit élevé ordonnançant des applications existe. L'ADN méthylé aura une conversion plus élevée de bisulfite de goujon de teneur de CHROMATOGRAPHIE GAZEUSE et l'ACP par rapport à ADN unmethylated, qui signifie là peut être au-dessus de représentation d'ADN méthylé en établissant ordonnançant des bibliothèques.

De plus, on a également remarqué la surreprésentation de l'ADN méthylé avec une augmentation du nombre de cycles pendant l'ACP et en raison de l'enzyme utilisée pour l'amplification d'ACP. L'étude recommande de limiter le nombre de cycles pendant l'ACP et pour employer une polymérase optimale pour amplifier la bibliothèque.

Quelques méthodes ont essayé d'éviter l'amplification d'ACP en établissant l'ADN ordonnançant des bibliothèques. Cependant, ceci ne fonctionne pas pour l'ADN traité avec du bisulfite parce que l'uracile empêcherait la formation de boîtier. Il devrait y avoir des réactifs, qui ont compris un ADN polymérase sensible à l'uracile. C'est pourquoi l'uracile est converti en thymines pendant l'ACP dans WGBS.

Les uracils dans l'ADN bisulfite-traité sont remplacés par l'amplification de l'ADN à varier des cycles d'ACP. De plus, des montants plus élevés d'entrée sont nécessaires pour la majorité de protocoles pendant que le traitement de bisulfite de sodium peut dégrader l'ADN menant aux limitations en ce qui concerne les échantillons qui peuvent être ordonnancés.

Pour améliorer l'exactitude de WGBS, les chercheurs développent les programmes qui emploient des dispositifs de cartographie de plus d'un bisulfite-Read. Ceci a prouvé pour augmenter l'exactitude du dépistage en réduisant les effets de l'hétérogénéité affichée sur trouver l'ADN méthylé aider de ce fait dans l'ordonnancement complet des caractéristiques de WGBS.

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Last Updated: Oct 31, 2018

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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