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Come l'ordinamento intero del bisolfuro del genoma funziona?

Gli avanzamenti recenti nell'ordinamento delle tecniche hanno permesso che l'intero sequenziamento del genoma diventasse più comune e più rapidamente. L'intero ordinamento del bisolfuro del genoma (WGBS) è una tale generazione seguente che ordina la tecnica che permette che gli utenti analizzino la metilazione del DNA a singola risoluzione bassa.

La metilazione del DNA è un meccanismo epigenetico che regolamenta l'espressione genica ed ha applicazioni in parecchi campi biologici, quali le malattie ed il cancro.

Lo scienziato analizza il gel del DNA utilizzato nella genetica, nella dialettica, nella scoperta della droga, nella biologia e nella medicina. Credito di immagine: Gopixa/Shutterstock
Lo scienziato analizza il gel del DNA utilizzato nella genetica, nella dialettica, nella scoperta della droga, nella biologia e nella medicina. Credito di immagine: Gopixa/Shutterstock

Metodologia

La metilazione è critica a parecchie funzioni biologiche ed ha un ruolo in determinati stati di malattia. L'espressione genica è regolamentata da metilazione del DNA reclutando le proteine o inibendo legare dei fattori di trascrizione a DNA. Si presenta durante lo sviluppo, dove contribuisce a regolamentare la trascrizione tessuto-specifica mentre le celle si differenziano.

WGBS combina la conversione di bisulfide del sodio della sequenza con l'alto ordinamento del DNA di capacità di lavorazione. La reazione del bisolfuro del sodio protegge i methylcytosines dalla conversione, mentre i cytosines unmethylated sono convertiti in uracile. Dopo la PCR, sono convertiti in thymines, mentre i cytosines metilati compariranno come cytosines. Methylcytosines è le versioni metilate delle basi della citosina. Ciò è fatta mediante il trasferimento del gruppo metilico sulla posizione C5 della citosina.

Bisulfite Sequencing

Il singolo polimorfismo del nucleotide (SNP) che genotyping o ordinamento della generazione seguente è usato spesso per l'interrogazione di metilazione del DNA di diversi siti di CpG. I siti di CpG sono citosina e guanina che sono separati da un gruppo del fosfato e sono conosciuti come siti di CG. Il methylome umano contiene intorno 28 milione siti di CG in esseri umani. Ci sono egualmente siti metilati non CG: CHG o CHH, dove la H rappresenta l'adenina, le timine, o la citosina.

Le librerie genomiche possono essere costruite dopo la conversione del bisolfuro. Uno dei primi esperimenti facendo uso di WGBS ha trovato che dopo la filtrazione per assicurare l'accuratezza nella loro libreria genomica, hanno coperto intorno 93% di tutti i cytosines che potrebbero essere coperti teoricamente. Ciò era simile a copertura classica veduta in un esperimento d'ordinamento convenzionale per un singolo luogo.

Tuttavia, il bisolfuro convertito ordinando le librerie mostra la diversità molto bassa perché le basi che compaiono sono principalmente adenina, guanina e timine, con una frazione molto piccola dei cytosines. Ciò è perché i cytosines che compaiono sono soltanto i cytosines metilati, mentre i cytosines unmethylated sono stati convertiti in timine.

L'ordinamento del genoma intero è generalmente abbastanza costoso. Di conseguenza, sebbene si sia applicato ai grandi genoma quale il genoma umano, tantissimi diversi campioni sono ordinati raramente. L'ordinamento diminuito del bisolfuro della rappresentazione (RRBS) è stato sviluppato per questo, in cui la reazione del bisolfuro si presenta ma l'ordinamento è limitato ad intorno 1% del genoma. Ciò permette all'ordinamento del genoma di parecchie persone.

Emissioni con metodologia corrente

È stato scoperto che una tendenziosità del contenuto di GASCROMATOGRAFIA nell'amplificazione delle sequenze di DNA per alta capacità di lavorazione che ordina le applicazioni esiste. Il DNA metilato avrà più alta conversione del bisolfuro del paletto del contenuto di GASCROMATOGRAFIA e la PCR rispetto a DNA unmethylated, che significa là può essere sopra la rappresentazione di DNA metilato quando costruisce ordinando le librerie.

Inoltre, la sovrarappresentazione di DNA metilato egualmente è stata notata con un aumento nel numero dei cicli durante la PCR e dovuto l'enzima usato per l'amplificazione di PCR. Lo studio raccomanda di limitare il numero dei cicli durante la PCR ed usare una polimerasi ottimale per ampliare la libreria.

Alcuni metodi hanno tentato di evitare l'amplificazione di PCR quando costruisce il DNA che ordina le librerie. Tuttavia, questo non funziona per DNA trattato con bisolfuro perché l'uracile inibirebbe la formazione del cluster. Dovrebbe essere reagenti, che hanno incluso una DNA polimerasi sensibile ad uracile. Ecco perché l'uracile è convertito in timine durante la PCR in WGBS.

I uracils nel DNA bisolfuro-trattato sono sostituiti dall'amplificazione del DNA a variare i cicli di PCR. Inoltre, le quantità elevate dell'input sono necessarie per la maggior parte dei protocolli mentre il trattamento del bisolfuro del sodio può degradare il DNA che piombo alle limitazioni riguardo ai campioni che possono essere ordinati.

Per migliorare l'accuratezza di WGBS, i ricercatori stanno sviluppando i programmi che usano i rilevamenti di più di un bisolfuro-read. Ciò è risultato aumentare l'accuratezza di rilevazione diminuendo gli effetti di eterogeneità colta sulla rilevazione del DNA metilato quindi aiutare nell'ordinamento completo dei dati di WGBS.

Sorgenti

  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18278030
  2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3521964/
  3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25374580
  4. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29668744
  5. https://www.researchgate.net/publication/286439183_An_integrative_approach_for_efficient_analysis_of_whole_genome_bisulfite_sequencing_data

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Last Updated: Oct 31, 2018

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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