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Como arranjar em seqüência inteiro do bissulfito do genoma trabalha?

Os avanços recentes em arranjar em seqüência técnicas permitiram o genoma inteiro que arranja em seqüência para tornar-se mais comuns e mais rapidamente. Arranjar em seqüência inteiro do bissulfito do genoma (WGBS) é uma tal próxima geração que arranja em seqüência a técnica que permite que os usuários analisem o methylation do ADN na única definição baixa.

O methylation do ADN é um mecanismo epigenético que regule a expressão genética e tenha aplicações em diversos campos biológicos, tais como doenças e cancro.

O cientista analisa o gel do ADN usado na genética, no forense, na descoberta da droga, na biologia e na medicina. Crédito de imagem: Gopixa/Shutterstock
O cientista analisa o gel do ADN usado na genética, no forense, na descoberta da droga, na biologia e na medicina. Crédito de imagem: Gopixa/Shutterstock

Metodologia

O Methylation é crítico a diversas funções biológicas e tem um papel em determinados estados da doença. A expressão genética é regulada pelo methylation do ADN recrutando proteínas ou inibindo a ligação de factores da transcrição ao ADN. Ocorre durante a revelação, onde ajuda a regular a transcrição tecido-específica enquanto as pilhas se diferenciam.

WGBS combina a conversão do bisulfide do sódio da seqüência com arranjar em seqüência alto do ADN da produção. A reacção do bissulfito do sódio protege methylcytosines da conversão, visto que os cytosines unmethylated são convertidos no uracil. Após o PCR, são convertidos em thymines, visto que os cytosines misturados aparecerão como cytosines. Methylcytosines é as versões misturadas das bases do cytosine. Isto é feito transferindo um grupo metílico na posição C5 do cytosine.

Bisulfite Sequencing

O único polimorfismo do nucleotide (SNP) que genotyping ou arranjar em seqüência da próxima geração é usado frequentemente para a interrogação do methylation do ADN de locais individuais de CpG. Os locais de CpG são cytosine e guanina que são separados por um grupo do fosfato, e são sabidos como locais do CG. O methylome humano contem ao redor 28 milhão locais do CG nos seres humanos. Há igualmente locais misturados não-CG: CHG ou CHH, onde H representa a adenina, o thymine, ou o cytosine.

As bibliotecas Genomic podem ser construídas após a conversão do bissulfito. Uma das primeiras experiências que usam WGBS encontrou que após a filtração para assegurar a precisão em sua biblioteca genomic, cobriram ao redor 93% de todos os cytosines que poderiam teòrica ser cobertos. Isto era similar à cobertura clássica vista em uma experiência bissulfito-arranjando em seqüência convencional para um único locus.

Contudo, o bissulfito convertido arranjando em seqüência as bibliotecas mostra a diversidade muito baixa porque as bases que aparecem são predominante adenina, guanina, e thymine, com uma fracção muito pequena dos cytosines. Isto é porque os cytosines que aparecem são somente os cytosines misturados, visto que os cytosines unmethylated foram convertidos no thymine.

Arranjar em seqüência o genoma inteiro é geralmente bastante caro. Conseqüentemente, embora seja aplicado aos grandes genomas tais como o genoma humano, um grande número amostras individuais são arranjadas em seqüência raramente. Arranjar em seqüência reduzido do bissulfito da representação (RRBS) foi desenvolvido para este, em que a reacção do bissulfito ocorre mas arranjar em seqüência é limitado a ao redor 1% do genoma. Isto permite arranjar em seqüência do genoma de diversos indivíduos.

Edições com metodologia corrente

Descobriu-se que uma polarização do índice do GC na amplificação de fragmentos do ADN para a produção alta que arranja em seqüência aplicações existe. O ADN misturado terá uma conversão mais alta do bissulfito do cargo do índice do GC e o PCR em comparação com o ADN unmethylated, que significa lá pode estar sobre a representação do ADN misturado ao construir arranjando em seqüência bibliotecas.

Além, o overrepresentation do ADN misturado foi observado igualmente com um aumento no número de ciclos durante o PCR e devido à enzima usada para a amplificação do PCR. O estudo recomenda limitar o número de ciclos durante o PCR e para usar uma polimerase óptima para amplificar a biblioteca.

Alguns métodos tentaram evitar a amplificação do PCR ao construir o ADN que arranja em seqüência bibliotecas. Contudo, isto não trabalha para o ADN tratado com o bissulfito porque o uracil inibiria a formação do conjunto. Precisaria de estar os reagentes, que incluíram uma polimerase de ADN sensível ao uracil. Eis porque o uracil é convertido ao thymine durante o PCR em WGBS.

Os uracils no ADN bissulfito-tratado são substituídos pela amplificação do ADN em variar ciclos do PCR. Além, umas quantidades mais altas da entrada são necessários para a maioria dos protocolos porque o tratamento do bissulfito do sódio pode degradar o ADN que conduz às limitações no que diz respeito às amostras que podem ser arranjadas em seqüência.

Para aumentar a precisão de WGBS, os pesquisadores estão desenvolvendo os programas que usam cartógrafos de mais de um bissulfito-read. Isto provou aumentar a precisão da detecção reduzindo os efeitos da heterogeneidade lida em detectar o ADN misturado desse modo ajudar em arranjar em seqüência detalhado de dados de WGBS.

Fontes

  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18278030
  2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3521964/
  3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25374580
  4. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29668744
  5. https://www.researchgate.net/publication/286439183_An_integrative_approach_for_efficient_analysis_of_whole_genome_bisulfite_sequencing_data

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Last Updated: Oct 31, 2018

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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