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¿Cómo la secuencia entera del bisulfito del genoma trabaja?

Los avances recientes en la secuencia de técnicas han permitido el genoma entero que ordenaba para llegar a ser mas comunes y más aprisa. La secuencia entera del bisulfito del genoma (WGBS) es una tal generación siguiente que ordena la técnica que permite que los utilizadores analicen la metilación de la DNA en la única resolución baja.

La metilación de la DNA es un mecanismo epigenético que regula la expresión génica y tiene usos en varios campos biológicos, tales como enfermedades y cáncer.

El científico analiza el gel de la DNA usado en genética, medecina legal, descubrimiento de la droga, biología y remedio. Haber de imagen: Gopixa/Shutterstock
El científico analiza el gel de la DNA usado en genética, medecina legal, descubrimiento de la droga, biología y remedio. Haber de imagen: Gopixa/Shutterstock

Metodología

La metilación es crítica a varias funciones biológicas y tiene un papel en ciertos estados de la enfermedad. La expresión génica es regulada por la metilación de la DNA reclutando las proteínas o inhibiendo atar de los factores de la transcripción a la DNA. Ocurre durante el revelado, donde ayuda a regular la transcripción tejido-específica mientras que las células distinguen.

WGBS combina la conversión del bisulfide del sodio de la serie con la alta secuencia de la DNA de la producción. La reacción del bisulfito del sodio protege methylcytosines contra la conversión, mientras que los cytosines unmethylated se convierten en el uracilo. Después de la polimerización en cadena, se convierten en thymines, mientras que los cytosines desnaturalizados aparecerán como cytosines. Methylcytosines es las versiones desnaturalizadas de las bases de la citosina. Esto es hecha transfiriendo a un grupo metílico sobre la posición C5 de la citosina.

Bisulfite Sequencing

El único polimorfismo del nucleótido (SNP) genotyping o secuencia de la generación siguiente es de uso frecuente para la interrogación de la metilación de la DNA de los sitios individuales de CpG. Los sitios de CpG son citosina y la guanina que son separados por un grupo del fosfato, y se conocen como sitios del CG. El methylome humano contiene alrededor 28 millones de sitios del CG en seres humanos. Hay también sitios desnaturalizados no-CG: CHG o CHH, donde H representa la adenina, el thymine, o la citosina.

Las bibliotecas Genomic se pueden construir después de la conversión del bisulfito. Uno de los primeros experimentos usando WGBS encontró que después de filtrar para asegurar exactitud en su biblioteca genomic, revistieron el alrededor 93% de todos los cytosines que podrían ser revestidos teóricamente. Esto era similar al abrigo clásico visto en un experimento de bisulfito-secuencia convencional para un único lugar geométrico.

Sin embargo, el bisulfito convertido ordenando las bibliotecas muestra diversidad muy inferior porque las bases que aparecen son predominante adenina, guanina, y thymine, con una fracción muy pequeña de cytosines. Esto es porque los cytosines que aparecen son solamente los cytosines desnaturalizados, mientras que los cytosines unmethylated se han convertido en el thymine.

La secuencia del genoma entero es generalmente muy costosa. Por lo tanto, aunque se haya aplicado a los genomas grandes tales como el genoma humano, un gran número de muestras individuales se ordenan raramente. La secuencia reducida del bisulfito de la representación (RRBS) se ha desarrollado para el, en las cuales la reacción del bisulfito ocurre pero la secuencia se limita al alrededor 1% del genoma. Esto habilita la secuencia del genoma de varios individuos.

Entregas con metodología corriente

Se ha descubierto que existe una polarización negativa del contenido de la CROMATOGRAFÍA GASEOSA en la amplificación de los fragmentos de la DNA para la alta producción que ordena usos. La DNA desnaturalizada tendrá conversión más alta del bisulfito del poste del contenido de la CROMATOGRAFÍA GASEOSA y la polimerización en cadena con respecto a la DNA unmethylated, que significa allí puede estar sobre la representación de la DNA desnaturalizada al construir ordenando bibliotecas.

Además, la sobrerepresentación de la DNA desnaturalizada también se ha notado con un aumento en el número de ciclos durante la polimerización en cadena y debido a la enzima usada para la amplificación de la polimerización en cadena. El estudio recomienda el limitar del número de ciclos durante la polimerización en cadena y utilizar una polimerasa óptima para amplificar la biblioteca.

Algunos métodos tentativa evitar la amplificación de la polimerización en cadena al construir la DNA que ordenaba bibliotecas. Sin embargo, esto no trabaja para la DNA tratada con bisulfito porque el uracilo inhibiría la formación del atado. Necesitaría ser los reactivos, que incluyeron una polimerasa de DNA sensible al uracilo. Esta es la razón por la cual el uracilo se convierte al thymine durante la polimerización en cadena en WGBS.

Los uracils en la DNA bisulfito-tratada son reemplazados por la amplificación de la DNA en la variación de ciclos de la polimerización en cadena. Además, cantidades más altas de la entrada son necesarias para la mayoría de protocolos mientras que el tratamiento del bisulfito del sodio puede degradar la DNA que lleva a las limitaciones con respecto a las muestras que pueden ser ordenadas.

Para aumentar la exactitud de WGBS, los investigadores están desarrollando los programas que utilizan cartógrafos de más de una bisulfito-lectura. Esto ha demostrado aumentar la exactitud de la detección reduciendo los efectos de la heterogeneidad leída sobre descubrir la DNA desnaturalizada de tal modo el ayudar en la secuencia completa de los datos de WGBS.

Fuentes

  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18278030
  2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3521964/
  3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25374580
  4. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29668744
  5. https://www.researchgate.net/publication/286439183_An_integrative_approach_for_efficient_analysis_of_whole_genome_bisulfite_sequencing_data

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Last Updated: Oct 31, 2018

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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