Como os anticorpos são conjugados?

Os anticorpos conjugados são usados em aproximações clínicas e não-clínicas diferentes. Por exemplo, a anticorpo-droga conjuga (ADCs) e os radioimmunoconjugates (RICs) podem ser usados na clínica para a entrega da terapêutica, visto que os anticorpos etiquetados com uma etiqueta fluorescente podem ser usados no laboratório para a imunofluorescência e a análise ocidental da mancha.

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Uma grande variedade de moléculas pode ser usada para a conjugação, e sua selecção é dependente da finalidade do conjugado do anticorpo, assim como do método preferido da conjugação.

In vivo as aplicações (CAD e RICs) tiram proveito extremamente das técnicas local-específicas da conjugação, enquanto se usa in vitro (imunofluorescência e análise ocidental da mancha) mais comumente envolvem a conjugação clássica do resíduo do ácido aminado.

In vitro ou in vivo?

In vitro os conjugado do anticorpo exigem somente a manutenção de especificidade e de afinidade obrigatórias do antígeno, visto que in vivo as aplicações devem igualmente ter a relação específica dos locais e do carga-à-anticorpo da alteração. Isto assegura a segurança e a eficácia.

Para ensaios anticorpo-baseados (immunoassays), o anticorpo usado para detectar o antígeno do interesse deve ser conjugado a uma molécula que possa ser detectada, referida frequentemente como a etiqueta. Os anticorpos de IgG, que são de uso geral para immunoassays, contêm as regiões que não são os locais antígeno-obrigatórios reais que têm a propensão ligar uma molécula de rotulagem (tal como a enzima ou o isótopo radioactivo).

As drogas citotóxicos limitadas aos anticorpos específicos do tumor (CAD) são uma maneira revolucionária de entregar tratamentos contra o cancro. Guardaram muitos benefícios tremendos tais como a redução da toxicidade sistemática, o aumento do potencial da pilha-matança, assim como a tolerabilidade paciente da droga. Quando a conjugação de moléculas radioactivas aos anticorpos específicos do tumor em RICs igualmente ajudar em entregar radiotherapies a um paciente, podem igualmente ser usados para estudos exactos da imagem lactente do cancro.

Locais da conjugação

Há uma miríade dos locais diferentes que podem ser usados em um anticorpo para ligar o conjugado; estas são primeiramente interacção forte da proteína-proteína (por exemplo domínio Fc-obrigatório), cysteines projetados, ácidos aminados naturais, locais obrigatórios do nucleotide, ácidos aminados não-naturais, o N-término da corrente pesada e clara, a parte do hidrato de carbono e etiquetas projetadas.

Ao usar resíduos naturais projetados ou reactivos como locais da conjugação, que é tipicamente lisina ou cysteine, há um desafio para controlar a estequiometria das reacções e para produzir a espécie consistente do anticorpo. Isto conduziu à revelação das técnicas tais como mutagêneses local-dirigidas, mas igualmente a outro que inclui etapas numerosas da enzima ou anfitriões de variação da proteína.

Conjugação do resíduo do ácido aminado

Embora quase todos os ácidos aminados poderiam ser candidatos potenciais para o local da conjugação, o tiolato reactivo no cysteine e a amina preliminar nucleophilic na lisina são escolhidos geralmente por pesquisadores.

técnicas Local-específicas da conjugação

a conjugação Local-específica difere da conjugação típica do resíduo do ácido aminado. A razão principal é que, ao contrário dos ácidos aminados abundantes nos anticorpos (tais como a lisina ou o cysteine), as conjugações local-específicas ligam moléculas somente ao local original e especialmente selecionado que foi feito através de uma estrutura com cuidado projetada do anticorpo.

Princípios de conjugação do anticorpo

Durante a conjugação, os grupos reactivos na etiqueta (b) e o anticorpo (a) formam uma ligação covalent um com o otro.

Há dois tipos principais de métodos de detecção do anticorpo: directo e indirecto. Isto significa que etiquetado e o anticorpo detectável pode directamente ser anexado ao antígeno, ou ser anexado a um anticorpo unlabelled que limite ao antígeno do interesse (o último que representa um método indirecto).

Em todo caso, o método indirecto tem mais etapas da incubação e da lavagem, visto que o método directo remove o risco de emperramento não específico que ocorre nos anticorpos secundários que produzirão resultados enganadores.

Escolhendo uma molécula da etiqueta

Há um número de opções diferentes ao escolher uma etiqueta que contenha um grupo B reactivo, por exemplo: biotina, partícula, enzima, tintura, proteína fluorescente e streptavidin. Esta decisão é vital e afectará como o investigador trata seu anticorpo e determina as alterações que anticorpo exigirão.

Um livro de texto pode ser consultado a que contem uma lista de grupos funcionais nos anticorpos, assim como os grupos conjugados associados do produto químico e os reactivos que poderiam estar na etiqueta. Embora haja uma lista extensiva de opções, os reagentes populares usados neste campo são lisina e glutamato e aspartato emparelhados (anticorpos); EDC, 2-IT e SMCC (produtos químicos conjugados); e Maleimide, NHS (succinimidyl) e tiolato (produtos químicos conjugados).

Evitando a necessidade de alterar o anticorpo quando escolher um grupo funcional for importante como a reacção directa dos grupos das reacções da etiqueta (b) para o anticorpo em seu formulário nativo e reduzirá o número de etapas exigidas. A maioria de etiquetas são disponíveis no comércio e não exigem o investigador produzir seus próprios.

Fontes

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Last Updated: Dec 11, 2018

Chloe Barnett

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Chloe Barnett

Chloe has a B.Sc. in Medical Sciences from the University of Leeds and during her time there she enjoyed being close to the Yorkshire dales. Chloe loves the outdoors, spending her spare time hiking and exploring the UK countryside as well as listening to live music and running.

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