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Come gli anticorpi sono convalidati?

Se un anticorpo non è specifico o abbastanza selettivo per la sua applicazione, legherà a vari epitopi, quindi diminuenti la sua accuratezza e costanti il tempo che la moneta del laboratorio sia. L'accuratezza egualmente è influenzata se gli anticorpi dallo stesso produttore o batch non generano i risultati riproducibili.

In generale, queste emissioni possono piombo ai falsi positivi ed all'eccessivo rumore di fondo, impedicenti la rilevazione dei risultati chiave. Di conseguenza, in un trattamento chiamato convalida dell'anticorpo, gli anticorpi sono provati per assicurarsi che siano selettivi, riproducibili ed abbastanza specifici per la loro applicazione.

Illustrazione di un anticorpo - rappresentazione del bastone e della palla - da Kateryna KonKateryna Kon | Shutterstock

Nel selezionare un metodo di convalida dell'anticorpo, l'uso desiderato dell'anticorpo deve essere considerato, con differenti applicazioni che richiedono i moduli differenti della convalida. Solo perché un anticorpo è adatto ad applicazione nel macchiare occidentale non significa che è adatto a ELISA. Di conseguenza, molti metodi differenti sono disponibili per la convalida degli anticorpi, come descritto qui sotto.

Convalida standard

Ci sono molti metodi tradizionali differenti disponibili per la convalida degli anticorpi. Per esempio, macchiare occidentale, macchiatura immunohistochemical, immunofluorescenza, spettroscopia di massa ed ordinare. Questi metodi sono tutti usati frequentemente per assicurarsi che l'antigene corretto sia selezionato e che c'è reattività crociata minima con altri antigeni.

Convalida migliorata

Gli sviluppi recenti piombo ai metodi novelli di convalida dell'anticorpo. Ci sono cinque colonne principali della convalida migliorata, includenti:

Convalida genetica

In questo metodo, l'obiettivo della proteina è abbattuto che utilizza uno di vari metodi (quali CRISPR o siRNA). Confronto fra l'anticorpo che macchia prima e dopo l'espulsione poi dimostra la specificità e la selettività dell'anticorpo, poichè un anticorpo altamente specifico non dimostrerà macchiatura quanto segue dell'espulsione della proteina.

Convalida ortogonale

In questo metodo, la quantità di rilevazione della proteina via il contrassegno dell'anticorpo è confrontata all'importo individuato via un metodo dell'anticorpo-indipendente. Se lo stesso reticolo è osservato in entrambi i metodi, quindi l'anticorpo è adatto ad applicazione. Tuttavia, se è differente, questo dimostra un'emissione con la specificità e la selettività.

Convalida indipendente dell'anticorpo

L'applicazione di un secondo, anticorpo precedentemente convalidato è un altro modo da cui l'associazione non specifica può essere individuata. In questo metodo, gli anticorpi con differenti epitopi che mirano allo stesso antigene sono utilizzati. Nel caso di un anticorpo specifico, gli anticorpi dimostrano i risultati identici con l'associazione limitata dell'fuori obiettivo. Tuttavia, questo metodo è laborioso e costoso e richiede un secondo anticorpo con un epitopo differente.

Convalida recombinante di espressione

In questo metodo, i livelli della proteina bersaglio sovra-sono espressi, o una versione fluorescente contrassegnata della proteina in modo endogeno è espressa. A seguito dell'anticorpo che contrassegna, i reticoli di macchiatura sono paragonati a quello della proteina bersaglio invariata.

Convalida del ms di bloccaggio

Per concludere, questo metodo comprende il confronto fra la dimensione della proteina e la macchia a quello dei risultati da sig.ra di bloccaggio.

In generale, la diversità di questi metodi differenti permette che gli scienziati assicurino l'idoneità dei loro anticorpi per le applicazioni multiple. Per esempio, gli anticorpi per immunocytochemistry stanno provando frequentemente con l'espressione genetica e recombinante e la convalida dell'anticorpo dell'indipendente, mentre quelle per il immunohistochemistry spesso sono provate soltanto con la convalida ortogonale o indipendente dell'anticorpo e quelle per la macchia occidentale sono provate spesso con tutti e 5 i metodi di variazione migliorati.

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Last Updated: Jan 8, 2019

Hannah Simmons

Written by

Hannah Simmons

Hannah is a medical and life sciences writer with a Master of Science (M.Sc.) degree from Lancaster University, UK. Before becoming a writer, Hannah's research focussed on the discovery of biomarkers for Alzheimer's and Parkinson's disease. She also worked to further elucidate the biological pathways involved in these diseases. Outside of her work, Hannah enjoys swimming, taking her dog for a walk and travelling the world.

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