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Como os anticorpos são validados?

Se um anticorpo não é específico ou selectivo bastante para sua aplicação, ligará a diversos resumos diferentes, desse modo reduzindo sua precisão e custando o tempo e o dinheiro do laboratório. A precisão é afectada igualmente se os anticorpos do mesmo fabricante ou grupo não geram resultados reprodutíveis.

Totais, estas edições podem conduzir aos falsos positivos e ao ruído de fundo excessivo, impedindo a detecção dos resultados chaves. Conseqüentemente, em um processo chamado validação do anticorpo, os anticorpos são testados a fim certificar-se de que são selectivos, reprodutível, e específico bastante para sua aplicação.

Ilustração de um anticorpo - representação da bola e da vara - por Kateryna KonKateryna Kon | Shutterstock

Ao selecionar um método da validação do anticorpo, o uso desejado do anticorpo deve ser considerado, com as aplicações diferentes que exigem formulários diferentes da validação. Apenas porque um anticorpo é apropriado para a aplicação na mancha ocidental não significa que é apropriado para um ELISA. Conseqüentemente, muitos métodos diferentes estão disponíveis para a validação dos anticorpos, como descrito abaixo.

Validação padrão

Há muitos métodos tradicionais diferentes disponíveis para a validação dos anticorpos. Por exemplo, mancha ocidental, mancha immunohistochemical, imunofluorescência, espectroscopia em massa, e arranjar em seqüência. Estes métodos são todos usados freqüentemente para assegurar-se de que o antígeno correcto esteja seleccionado e que há uma reactividade cruzada mínima com outros antígenos.

Validação aumentada

As revelações recentes conduziram aos métodos novos da validação do anticorpo. Há cinco colunas principais da validação aumentada, incluindo:

Validação genética

Neste método, o alvo da proteína é batido abaixo de utilizar um de diversos métodos diferentes (tais como CRISPR ou siRNA). Comparação entre o anticorpo que mancha antes e depois de que o KO demonstra então a especificidade e a selectividade do anticorpo, porque um anticorpo altamente específico não demonstrará nenhuma mancha de seguir o KO da proteína.

Validação ortogonal

Neste método, a quantidade de detecção da proteína através da rotulagem do anticorpo é comparada à quantidade detectada através de um método anticorpo-independente. Se o mesmo teste padrão é observado em ambos os métodos, a seguir o anticorpo é apropriado para a aplicação. Contudo, se é diferente, isto demonstra uma edição com especificidade e selectividade.

Validação independente do anticorpo

A aplicação de um segundo, anticorpo previamente validado é uma outra maneira por que o emperramento não específico pode ser detectado. Neste método, os anticorpos com resumos diferentes que visam o mesmo antígeno são utilizados. No caso de um anticorpo específico, os anticorpos demonstram resultados idênticos com o emperramento limitado do fora-alvo. Contudo, este método é laborioso e caro e exige um segundo anticorpo com um resumo diferente.

Validação de recombinação da expressão

Neste método, os níveis da proteína do alvo sobre-são expressados, ou uma versão fluorescente etiquetada da proteína é expressada endògena. Depois do anticorpo que etiqueta, os testes padrões de mancha são comparados com o aquele da proteína unmodified do alvo.

Validação do MS da captação

Finalmente, este método envolve a comparação entre o tamanho da proteína e a mancha àquela dos resultados da Senhora da captação.

Total, a diversidade destes métodos diferentes permite que os cientistas assegurem a conformidade de seus anticorpos para aplicações múltiplas. Por exemplo, os anticorpos para immunocytochemistry estão testando freqüentemente com expressão genética, de recombinação e a validação independente do anticorpo, visto que aquelas para o immunohistochemistry frequentemente são testadas somente com validação ortogonal ou independente do anticorpo, e aquelas para a mancha ocidental são testadas frequentemente com todos os 5 métodos de variação aumentados.

Fontes

Further Reading

Last Updated: Jan 8, 2019

Hannah Simmons

Written by

Hannah Simmons

Hannah is a medical and life sciences writer with a Master of Science (M.Sc.) degree from Lancaster University, UK. Before becoming a writer, Hannah's research focussed on the discovery of biomarkers for Alzheimer's and Parkinson's disease. She also worked to further elucidate the biological pathways involved in these diseases. Outside of her work, Hannah enjoys swimming, taking her dog for a walk and travelling the world.

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