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Comment PBMCs vont-ils a-t-il isolé ?

Analyser les cellules mononucléaires périphériques de sang (PBMCs) est une approche méthodologique importante employée pour évaluer le statut du système immunitaire d'une personne. En bref, PBMCs comprennent des cellules de B, des cellules de T, des cellules tueuses naturelles (NK), et des cellules dendritiques.

Sang total contenant PMBCs - une illustration par Christoph BurgstedtChristoph Burgstedt | Shutterstock

Comment isoler PBMCs de sang total

Dilution

Du sang peut être enregistré à la température ambiante avant d'isoler PBMCs, et être puis remélangé en inversant le tube de ramassage 6-8 fois. Après essuyage du tube avec de l'éthanol de 70%, les teneurs devraient être transférés à un autre tube qui peut au moins retenir deux fois le volume de sang transféré.

Maintenant, le sang peut être dilué avec un volume égal de saline tamponné aux phosphates (PBS). Dans certains cas, le support commémoratif d'institut de stationnement (RPMI) de Roswell est employé au lieu de PBS pour augmenter la viabilité des cellules. La chose importante est que le sang et les medias devraient être mélangés suffisamment.

Séparation utilisant la centrifugation de gradient de densité

Ficoll PAQUE, un support stérile, est ajouté au bas du tube neuf. En cas de 6-10 ml de sang dilué, 4 ml de Ficoll PAQUE peuvent être ajoutés ; considérant que 30-35 ml de sang dilué devraient être dilués avec 20 ml de Ficoll PAQUE peut être ajouté. Le sang dilué alors est lentement ajouté aux medias de gradient de densité et la centrifugation est exécutée pendant environ 20 mn. Les couches sakis chamoises devraient être centrifugées à 1900 révolutions par minute (rpm), alors que le sang total devrait être centrifugé à 1300 t/mn.

Ceci devrait être fait sans freins, car la De-accélération peut perturber la formation de gradient de densité. La centrifugeuse ne devrait pas secouer pendant le procédé, et en pareil cas, le dispositif devrait être arrêté immédiatement, repesé et équilibré.

Rassemblement de PBMCs

Pendant le lavage de PBMCs, des précautions devraient être prises pour s'assurer qu'il n'y a aucune contamination des plaquettes. Des tubes coniques stériles neufs avec le même volume que la centrifugation de densité devraient être utilisés pour contenir le PBMCs et autant du plasma que possible devrait être retiré.

Les cellules de couche unitaire du plasma peuvent être rassemblées utilisant un transfert introduisent à la pipette. Ces cellules peuvent être transférées à un tube neuf ; cependant, les cellules ne devraient pas être mises en commun encore. Seulement le plasma devrait être aspiré pendant le ramassage et chaque tube peut alors être rempli de PBS.

Pendant le premier lavage, les cellules devraient être tournées à 1300 t/mn pendant 8 mn. Après le procédé, le surnageant peut être soigneusement retiré et la boulette peut être resuspendue dans 1 millilitre PBS. Dans le deuxième lavage, la solution devrait être centrifugée à 1300 t/mn pendant 8 mn, le surnageant est retiré, et la boulette est resuspendue dans 1 ml PBS.

Après avoir exécuté une autre opération de lavage, les cellules du même donneur peuvent être mises en commun, et pour retirer des plaquettes, la solution est centrifugée à la basse vitesse de 1000 t/mn pendant 10 mn. Cette opération peut être retirée si le volume du sang est inférieur.

Compte et viabilité de PBMC

Après la dernière opération, le surnageant peut être retiré et la boulette être resuspendu dans 1mL PBS. PBS peut être ajouté tels que la concentration est 5 x 106 cells/mL. Utilisant le cellometer, la concentration et la viabilité en cellules peuvent être déterminées.

La dernière opération rend nécessaire souiller des cellules avec l'orange d'acridine (qui souille des noyaux) et iodure de propidium (afin de souiller les cellules compromises avec les membranes endommagées). Pour ceci, le µL 20 des cellules peut être mélangé au µL 20 de l'orange d'acridine/de iodure de propidium. Après avoir mélangé 5 fois et avoir chargé dedans à la chambre, la cellule et toute la concentration sous tension en cellules peuvent être recodées sur la machine.

Congélation de PBMC

Les cellules peuvent être tournées à 1300 t/mn pendant 8 mn et, par la suite, le surnageant peut être retiré. La boulette peut être resuspendue dans le rhume FBS à une concentration de 4 x 107 cell/mL.

Les cellules peuvent être encore détachées/retirées par davantage d'introduire à la pipette doucement avec FBS. Puis, le même montant de rhume FBS est ajouté goutte-à-goutte tout en doucement mélangeant la suspension de cellules. Après mélange en introduisant à la pipette doucement, 1mL de cette solution peut être ajouté à un cryotube et être gelé.

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Last Updated: Jan 3, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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