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Come è PBMCs ha isolato?

Analizzare le celle mononucleari di sangue periferico (PBMCs) è un approccio metodologico importante usato per valutare lo stato del sistema immunitario di una persona. In breve, PBMCs comprende le celle di T, dei linfociti B, le celle di uccisore (NK) naturali e le celle dentritiche.

Intero sangue che contiene PMBCs - unChristoph Burgstedt | Shutterstock

Come isolare PBMCs da intero sangue

Diluizione

Il sangue può essere memorizzato alla temperatura ambiente prima dell'isolazione del PBMCs e poi essere rimescolato invertendo il tubo della raccolta 6-8 volte. Dopo la pulitura del tubo con l'etanolo di 70%, i contenuti dovrebbero essere trasferiti ad un altro tubo che può tenere almeno due volte il volume di sangue trasferito.

Ora, il sangue può essere diluito con un volume uguale di salino tamponato con i fosfati (PBS). In determinati casi, il media commemorativo dell'istituto della sosta (RPMI) di Roswell è usato invece di PBS per aumentare l'attuabilità delle celle. La cosa importante è che il sangue ed i media dovrebbero essere misti sufficientemente.

Separazione facendo uso di centrifugazione di gradiente di densità

Ficoll PAQUE, un media sterile, si aggiunge al fondo di nuovo tubo. Nel caso di 6-10 ml di sangue diluito, 4 ml di Ficoll PAQUE possono aggiungersi; considerando che 30-35 ml di sangue diluito dovrebbero essere diluiti con 20 ml di Ficoll PAQUE può aggiungersi. Il sangue diluito poi si aggiunge lentamente ai media di gradiente di densità e la centrifugazione è realizzata per intorno 20 minuti. I cappotti buffy dovrebbero essere centrifugati a 1900 giri al minuto (rpm), mentre l'intero sangue dovrebbe essere centrifugato a 1300 giri/min.

Ciò dovrebbe essere fatta a meno dei freni, poichè l'de-accelerazione può interrompere la formazione di gradiente di densità. La centrifuga non dovrebbe scuotere durante il trattamento ed in tali casi, l'unità dovrebbe essere bloccata immediatamente, essere ripesata e saldata.

Raccolta del PBMCs

Durante il lavaggio di PBMCs, le precauzioni dovrebbero essere catturate per assicurarsi che non ci sia contaminazione delle piastrine. I nuovi tubi conici sterili con lo stesso volume della centrifugazione di densità dovrebbero essere utilizzati per contenere il PBMCs e tanto del plasma come possibile dovrebbe essere eliminato.

Le celle dello strato monomolecolare dal plasma possono essere raccolte facendo uso di un trasferimento pipettano. Queste celle possono essere trasferite ad un nuovo tubo; tuttavia, le celle non dovrebbero essere riunite ancora. Soltanto il plasma dovrebbe essere aspirato durante la raccolta ed ogni tubo può poi essere riempito di PBS.

Durante il primo lavaggio, le celle dovrebbero essere filate a 1300 giri/min. per 8 minuti. Dopo che il trattamento, il galleggiante può essere eliminato con attenzione e la pallina può essere risospesa in 1 millilitro PBS. Nel secondo lavaggio, la soluzione dovrebbe essere centrifugata a 1300 giri/min. per 8 minuti, il galleggiante è eliminato e la pallina è risospesa in 1 ml PBS.

Dopo l'esecuzione deun'altra operazione del lavaggio, le celle dallo stesso donatore possono essere riunite ed eliminare le piastrine, la soluzione è centrifugata ad a bassa velocità di 1000 giri/min. per 10 minuti. Questo punto può essere eliminato se il volume del sangue è basso.

Conteggio ed attuabilità di PBMC

Dopo l'ultimo punto, il galleggiante può essere eliminato e la pallina essere risospeso in 1mL PBS. PBS può aggiungersi tali che la concentrazione è 5 x 106 cells/mL. Facendo uso del cellometer, la concentrazione e l'attuabilità nelle cellule possono essere risolute.

L'ultimo punto necessita la macchiatura delle celle con l'arancia dell'acridina (che macchia i nuclei) ed ioduro di propidium (per macchiare le celle compromesse con le membrane nocive). Per questo, il µL 20 delle celle può essere misto con µL 20 dell'arancia dell'acridina/ioduro di propidium. Dopo la mescolanza delle 5 volte ed il carico dentro alla camera, la cella e la concentrazione totale in tensione nelle cellule possono essere ricodificate sul commputer.

Congelamento di PBMC

Le celle possono essere filate a 1300 giri/min. per 8 minuti e, successivamente, il galleggiante può essere eliminato. La pallina può essere risospesa in FBS freddo ad una concentrazione di 4 x 107 cell/mL.

Le celle possono essere più ulteriormente distaccate/eliminate da ulteriore delicatamente prelevamento con FBS. Poi, la stessa quantità di FBS freddo si aggiunge a goccia a goccia mentre delicatamente mescola la sospensione delle cellule. Dopo la mescolanza delicatamente pipettando, 1mL di questa soluzione può aggiungersi ad un cryotube ed essere congelato.

Sorgenti

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Last Updated: Jan 3, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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