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Como é PBMCs se isolou?

Analisar pilhas mononuclear do sangue periférico (PBMCs) é uma abordagem metodológica importante usada para avaliar o estado do sistema imunitário de uma pessoa. Em curto, PBMCs inclui pilhas de B, pilhas de T, pilhas de assassino (NK) naturais, e pilhas dendrítico.

Sangue inteiro que contem PMBCs - uma ilustração por Christoph BurgstedtChristoph Burgstedt | Shutterstock

Como isolar PBMCs do sangue inteiro

Diluição

O sangue pode ser armazenado na temperatura ambiente antes de isolar PBMCs, e então ser remixed invertendo a câmara de ar da coleção 6-8 vezes. Após ter limpado a câmara de ar com o álcool etílico de 70%, os índices devem ser transferidos a uma outra câmara de ar que possa pelo menos guardarar duas vezes o volume de sangue transferido.

Agora, o sangue pode ser diluído com um volume igual de salino fosfato-protegido (PBS). Em certos casos, o media memorável do instituto do parque (RPMI) de Roswell é usado em vez de PBS para aumentar a viabilidade das pilhas. A coisa importante é que o sangue e os media devem ser misturados suficientemente.

Separação usando a centrifugação do inclinação de densidade

Ficoll PAQUE, um media estéril, é adicionado à parte inferior da câmara de ar nova. Em caso de 6-10 ml do sangue diluído, 4 ml de Ficoll PAQUE podem ser adicionados; considerando que 30-35 ml do sangue diluído devem ser diluídos com os 20 ml de Ficoll PAQUE pode ser adicionado. O sangue diluído é adicionado então lentamente aos media do inclinação de densidade e a centrifugação é executada por ao redor 20 minutos. Os revestimentos buffy devem ser centrifugados em 1900 revoluções pela acta (rpm), quando o sangue inteiro dever ser centrifugado em 1300 RPM.

Isto deve ser feito sem os freios, porque a de-aceleração pode interromper a formação do inclinação de densidade. O centrifugador não deve agitar durante o processo, e nesses casos, o dispositivo deve ser parado imediatamente, reweighed e equilibrado.

Recolhendo PBMCs

Durante a lavagem de PBMCs, as precauções devem ser tomadas para assegurar-se de que não haja nenhuma contaminação das plaqueta. As câmaras de ar cónicas estéreis novas com mesmo volume que a centrifugação da densidade devem ser usadas para conter o PBMCs e tanto quanto do plasma como possível deve ser removido.

As pilhas do monolayer do plasma podem ser recolhidas usando transferência introduzem com pipeta. Estas pilhas podem ser transferidas a uma câmara de ar nova; contudo, as pilhas não devem ser associadas ainda. Somente o plasma deve ser aspirado durante a coleção e cada câmara de ar pode então ser enchida com o PBS.

Durante a primeira lavagem, as pilhas devem ser giradas em 1300 RPM por 8 minutos. Após o processo, o supernatant pode com cuidado ser removido e a pelota pode ser resuspended em 1 mililitro PBS. Na segunda lavagem, a solução deve ser centrifugada em 1300 RPM por 8 minutos, o supernatant é removido, e a pelota resuspended em 1 mL PBS.

Após ter executado uma outra etapa da lavagem, as pilhas do mesmo doador podem ser associadas, e para remover as plaqueta, a solução é centrifugada em de baixa velocidade de 1000 RPM por 10 minutos. Esta etapa pode ser removida se o volume do sangue é baixo.

Contagem e viabilidade de PBMC

Após a última etapa, o supernatant pode ser removido e a pelota ser resuspended em 1mL PBS. PBS pode ser adicionado tais que a concentração é 5 x 106 cells/mL. Usando o cellometer, a concentração da pilha e a viabilidade podem ser determinadas.

A última etapa necessita a mancha de pilhas com laranja da acridina (que mancha núcleos) e iodeto do propidium (a fim manchar pilhas comprometidas com membranas danificadas). Para isto, o µL 20 das pilhas pode ser misturado com o µL 20 da laranja da acridina/iodeto do propidium. Após ter misturado 5 vezes e o carregamento dentro à câmara, a pilha e a concentração total vivas da pilha podem ser recoded na máquina.

Congelação de PBMC

As pilhas podem ser giradas em 1300 RPM por 8 minutos e, subseqüentemente, o supernatant pode ser removido. A pelota pode ser resuspended em FBS frio em uma concentração de 4 x 107 cell/mL.

As pilhas podem mais ser destacadas/removido delicadamente introduzir com pipeta mais adicional com o FBS. Então, a mesma quantidade de FBS frio é adicionada gota a gota ao delicadamente misturar a suspensão da pilha. Após a mistura delicadamente introduzindo com pipeta, 1mL desta solução pode ser adicionado a um cryotube e ser congelado.

Fontes

Further Reading

Last Updated: Jan 3, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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