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¿Cómo está PBMCs aisló?

Analizar las células mononucleares de la sangre periférica (PBMCs) es una aproximación metodológica importante usada para evaluar el estado del sistema inmune de una persona. En fin, PBMCs incluye las células de B, las células de T, las células de asesino (NK) naturales, y las células dendríticas.

Sangre entera que contiene PMBCs - un ejemplo de Cristóbal BurgstedtCristóbal Burgstedt | Shutterstock

Cómo aislar PBMCs de la sangre entera

Dilución

La sangre puede ser salvada en la temperatura ambiente antes de aislar PBMCs, y después ser remezclada invirtiendo el tubo de la colección 6-8 veces. Después de limpiar el tubo con etanol del 70%, los contenidos se deben transferir a otro tubo que pueda por lo menos llevar a cabo dos veces el volumen de sangre transferida.

Ahora, la sangre se puede diluir con un volumen igual de salino fosfato-protegida (PBS). En ciertos casos, el ambiente conmemorativo del instituto del parque (RPMI) de Roswell se utiliza en vez de PBS para aumentar la viabilidad de células. La cosa importante es que la sangre y los ambientes se deben mezclar suficientemente.

Separación usando la centrifugación del gradiente de densidad

Ficoll PAQUE, un ambiente estéril, se agrega a la parte inferior del nuevo tubo. En caso de 6-10 ml de sangre diluida, 4 ml de Ficoll PAQUE pueden ser agregados; considerando que 30-35 ml de sangre diluida se deben diluir con 20 ml de Ficoll PAQUE puede ser agregado. La sangre diluida entonces se agrega despacio a los ambientes del gradiente de densidad y la centrifugación se realiza por alrededor 20 minutos. Las cubiertas anteadas se deben centrifugar en 1900 revoluciones por minuto (rpm), mientras que la sangre entera se debe centrifugar en 1300 revoluciones por minuto.

Esto se debe hacer sin los frenos, pues la de-aceleración puede romper la formación del gradiente de densidad. La centrifugadora no debe sacudir durante el proceso, y en estos casos, el dispositivo debe ser parado inmediatamente, ser pesado de nuevo y ser equilibrado.

Cerco de PBMCs

Durante el lavado de PBMCs, las precauciones se deben tomar para asegurarse de que no hay contaminación de las plaquetas. Los nuevos tubos cónicos estéril con el mismo volumen que la centrifugación de la densidad se deben utilizar para contener el PBMCs y tanto del plasma como posible debe ser quitado.

Las células de la capa monomolecular del plasma se pueden cerco usando una transferencia miden con una pipeta. Estas células se pueden transferir a un nuevo tubo; sin embargo, las células no se deben reunir todavía. Solamente el plasma se debe aspirar durante la colección y cada tubo se puede entonces llenar de PBS.

Durante la primera estela turbulenta, las células se deben hacer girar en 1300 revoluciones por minuto por 8 minutos. Después del proceso, el sobrenadante puede ser quitado cuidadosamente y la bolita se puede suspender de nuevo en 1 mililitro PBS. En la segunda estela turbulenta, la solución se debe centrifugar en 1300 revoluciones por minuto por 8 minutos, se quita el sobrenadante, y la bolita se suspende de nuevo en 1 ml PBS.

Después de realizar otro paso de la estela turbulenta, las células del mismo donante pueden ser reunidas, y quitar las plaquetas, la solución se centrifuga en de poca velocidad de 1000 revoluciones por minuto por 10 minutos. Este paso puede ser quitado si el volumen de la sangre es inferior.

Cuenta y viabilidad de PBMC

Después del paso pasado, el sobrenadante se puede ser quitado y la bolita suspender de nuevo en 1mL PBS. PBS puede ser agregado tales que la concentración es 5 x 106 cells/mL. Usando cellometer, la concentración y la viabilidad de la célula pueden ser resueltas.

El paso pasado necesita la coloración de las células con la naranja de la acridina (que mancha núcleos) y yoduro del propidium (para manchar las células comprometidas con las membranas dañadas). Para esto, el µL 20 de células se puede mezclar con el µL 20 de la naranja de la acridina/del yoduro del propidium. Después de mezclar 5 veces y de cargar hacia adentro a la cámara, la célula y la concentración total vivas de la célula se pueden recodificar en la máquina.

Congelación de PBMC

Las células se pueden hacer girar en 1300 revoluciones por minuto por 8 minutos y, posteriormente, el sobrenadante puede ser quitado. La bolita se puede suspender de nuevo en FBS frío en una concentración de 4 x 107 cell/mL.

Las células se pueden destacar/quitar más a fondo por suavemente medir con una pipeta adicional con FBS. Entonces, la misma cantidad de FBS frío se agrega gota a gota mientras que suavemente mezcla la suspensión de la célula. Después de mezclar suavemente midiendo con una pipeta, 1mL de esta solución puede ser agregado a un cryotube y ser congelado.

Fuentes

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Last Updated: Jan 3, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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