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Come i fotodiodi sono utilizzati nella citometria a flusso?

I rivelatori fotoelettrici sono utilizzati in cytometers di flusso per tradurre il fluorophore emozionante attaccano photocurrent in moda da poterlo digitalmente essere memorizzato ed analizzare. Uno dei tipi più comuni di rivelatori fotoelettrici è fotodiodi.

fotodiodo

Credito di immagine: Auhustsinovich/Shutterstock.com

Citometria a flusso

La citometria a flusso è una tecnica usata per l'analisi quantitativa e qualitativa delle celle e delle particelle. Funziona analizzando le celle mentre passano uno per uno attraverso i cytometer di flusso scorrono. Le celle o le particelle sono etichettate con i fluorophores tinti. I fluorophores sono eccitati da una sorgente luminosa, quale un laser.

I fluorophores emettono i fotoni una volta eccitati dalla sorgente luminosa ed è questo indicatore luminoso che è tradotto in photocurrent. Ciò tiene conto sia informazioni sull'oggetto che è stato etichettato con il fluorophore, quale la dimensione delle cellule che per quantificazione delle sue componenti, quali le strutture sottocellulari. Poiché parecchie tinture possono essere usate simultaneamente, così permettendo a più informazione dettagliata su parecchie componenti cellulari.

Come i fotodiodi funzionano?

I rivelatori del fotodiodo utilizzano i catodi e gli anodi per trasformare i fotoni a photocurrent. Il photocurrent è un termine alternativo per la corrente elettrica che può essere generata dai fotoni fluorophore. Prima che arrivi al rivelatore fotoelettrico, la luce fluorescente è divisa in base alla lunghezza d'onda. Ciò è fatta mediante sia una combinazione di specchi dicromatici che sia filtri lunghi dal passaggio di scarsità che dal passaggio.

Ogni lunghezza d'onda illumina l'area attiva di un rivelatore fotoelettrico scelto, quale il fotodiodo. Il primo punto della funzione di un fotodiodo è quando il fotone colpisce il fotodiodo ed ionizza gli atomi del rivelatore.

Questa ionizzazione crea un paio di un elettrone e un foro all'interno del fotodiodo, in un'area chiamata la regione di svuotamento. Nella regione di svuotamento, gli elettroni avanzano verso il potenziale positivo del catodo. I fori si muovono nella direzione opposta, verso il potenziale negativo dell'anodo. Questo movimento crea un photocurrent, che può spostarsi per verso il sistema di elettronica.

Nella maggior parte dei casi, il photocurrent prodotto dal fotodiodo è moltiplicato ad un livello appropriato. Il photocurrent poi passa verso l'amplificatore, in cui il segnale è ampliato e trasformato ad un impulso di tensione. Occasionalmente, una resistenza cattura questo ruolo, invece. Il moltiplicatore di focale analogico-digitale è responsabile della trasformazione dell'impulso ad un numero digitale, che si trasforma nei dati da analizzare.

Vantaggi e limitazioni dei fotodiodi

I fotodiodi sono uno dei rivelatori fotoelettrici stabiliti che possono essere utilizzati nella citometria a flusso e spesso sono fatti di silicio. Altri tipi includono i fotomoltiplicatori ed i fotodiodi della valanga, che sono una versione leggermente più avanzata dei fotodiodi.

Questi tipi differenti di rivelatori fotoelettrici hanno risposte spettrali differenti dovuto le lunghezze d'onda differenti. I tipi differenti di rivelatori fotoelettrici possono essere usati congiuntamente allo stesso cytometer di flusso, secondo la lunghezza d'onda dell'indicatore luminoso, il inity e la durata di impulso.

Le risposte spettrali sono perché i fotodiodi sono utilizzati tipicamente meglio per le misure leggere dello spargimento dalla corrispondenza dei fotodiodi con quella lunghezza d'onda leggera. Ciò anche legami dentro con i fotodiodi standard del tema può essere usata sullo spargimento leggero agli angoli bassi intorno a 0° a 20°. Poiché lo spargimento leggero di andata è sensibile alla dimensione delle cellule, questo può essere usato sulle intere celle mentre le più piccole particelle, quali i virus, richiedono i più grandi angoli.

I fotodiodi sono utilizzati tipicamente quando il segnale dello spargimento di andata è alto, rispetto a quando spargimento laterale ed i segnali fluorescenti sono usati (questi tendono ad essere più deboli dei segnali dello spargimento di andata). Tuttavia, se il laser o la sorgente luminosa direttamente entra nel fotodiodo, il segnale può trasformarsi in in modo schiacciante ed in risultato in troppo disturbo. I fotodiodi possono essere utilizzati per lo spargimento laterale e quando i segnali fluorescenti sono più deboli, ma questo richiederebbero l'elettronica più costosa della parte frontale di abbassare il rapporto di segnale/disturbo.

Mentre i fotodiodi sono relativamente economici e quindi largamente accessibile, hanno sensibilità più bassa che altri rivelatori fotoelettrici. Ciò pricipalmente è attribuita al fatto che i fotodiodi non ampliano il photocurrent allo stesso grado altri rivelatori fotoelettrici, quali i fotomoltiplicatori.

I cytometers di flusso con i fotodiodi sono utilizzati il più bene nei 350 all'intervallo di 1000 nanometro. La corrente di massimo di circa 0,5 A/W è a circa 900 nanometro. Tuttavia, la corrente ad alto rendimento dipende dalla potenza del laser utilizzato per accendere il campione, i beni delle cellule e la dimensione dell'obiettivo. Mentre i valori normali tendono ad essere nell'intervallo del µA, che insinua la potenza radiante superiore è nell'intervallo del µW.

Sorgenti

  • Piatek, S. e Hergert, E., 2018. Rivelatori fotoelettrici nel flusso Cytometers. Photonics.com [online]. Disponibile a: < https://www.photonics.com/Articles/Photodetectors_in_Flow_Cytometers/a64058 >
  • Thermofisher.com. 2020. Ottica di un flusso Cytometer. [online] disponibile a: < https://www.thermofisher.com/au/en/home/life-science/cell-analysis/cell-analysis-learning-center/molecular-probes-school-of-fluorescence/flow-cytometry-basics/flow-cytometry-fundamentals/optics-flow-cytometer.html >
  • Phinney, D. e Cucci, T., 1989. Citometria a flusso e fitoplancton. Cytometry, 10(5), pp.511-521.
  • Bakke, A., 2001. I principi di citometria a flusso. Medicina del laboratorio, 32(4), pp.207-211.
  • Thermofisher scientifico. 2020. Elettronica di un flusso Cytometer. [online] disponibile a: < https://www.thermofisher.com/au/en/home/life-science/cell-analysis/cell-analysis-learning-center/molecular-probes-school-of-fluorescence/flow-cytometry-basics/flow-cytometry-fundamentals/electronics-flow-cytometer.html >

Last Updated: Sep 8, 2020

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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