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Come scegliere un anticorpo specifico all'applicazione

Che cosa sono anticorpi e come essi sono utilizzati nella ricerca?

Gli anticorpi sono proteine fabbricate dai linfociti B all'interno dei sistemi immunitari di più alte forme di vita come funzionalità adattabile per permettere che l'organismo indirizzi le molecole non Xeros d'invasione che rappresentano una minaccia all'organismo. La funzione naturale degli anticorpi comprende il loro collegamento agli antigeni (che appartengono ai corpi estranei d'invasione), per inbandierarle per la distruzione dal sistema immunitario.

anticorpiCrediti di immagine: Design_Cells/Shutterstock.com

Questa tendenza innata a fissarsi alle molecole specifiche ha stabilito il loro uso nella ricerca scientifica. Poiché gli anticorpi specifici possono essere scelti che sono conosciuti per chiudere su determinati antigeni, i ricercatori possono usare gli anticorpi per identificare la presenza di determinate sostanze. Di conseguenza, l'uso degli anticorpi è stato considerato molto nello studio sulla funzione della proteina in celle.

Le numerose tecniche sono state sviluppate che sfruttano la natura degli anticorpi per studiare le proteine nelle celle ed in tessuti. Le applicazioni quali la macchia del immunohistochemistry, ELISA, citometria a flusso e FACS e ELISPOT immunocytochemistry e occidentali, sono tutte metodi stabiliti che utilizzano gli anticorpi.

Per fare il la maggior parte di queste tecniche investigative potenti, è essenziale che l'anticorpo corretto sia scelto che è adatta all'applicazione specifica. Sotto discutiamo come scegliere l'anticorpo corretto per la vostra applicazione.

Scelta dell'applicazione giusta

Il primo punto di scelta dell'anticorpo giusto per il vostro esperimento è di assicurarsi che selezioniate l'applicazione corretta che è la più adatta a vostri scopi della ricerca. Sotto, descriviamo le funzionalità principali di vari metodi:

Domande di studio della localizzazione

Il Immunohistochemistry ha un minimo a capacità di lavorazione media, può essere usato per le celle ed i tessuti fissi, può produrre la localizzazione cellulare, ha un'alta risoluzione spaziale, tipicamente mette a fuoco su una singola proteina, può proteine multiple di immagine immediatamente ed è qualitativo e semiquantitativo.

L'altra tecnica che studia la localizzazione è immunocytochemistry. Questa tecnica ha un minimo ad alta capacità di lavorazione, può essere usata per le celle ed i tessuti fissi, può produrre la localizzazione sottocellulare, può proteine multiple di immagine immediatamente ed è qualitativa e semiquantitativa. Tuttavia, la sua risoluzione spaziale è limitata dalla struttura del tessuto.

Domande di studio della concentrazione

La macchia occidentale è la tecnica appropriata per lo studio della concentrazione nella proteina. Ha un minimo a capacità di lavorazione media, può essere usata per i lysates del tessuto e delle cellule, genera i livelli relativi della proteina, può stabilire il peso molecolare, le isoforme e le modifiche post-di traduzione ed è semiquantitativa.

Domande di studio dell'interazione

ELISA è la tecnica appropriata per lo studio delle interazioni della proteina. Il metodo ha un media a capacità di lavorazione alta (una lastra grossa di 96 pozzi), può essere usato per studiare il siero/plasma, in tensione o celle e tessuto fissi, produce i livelli accurati della proteina, è quantitativo e qualitativo.

Domande di studio dell'espressione

ELISA può anche essere usato per lo studio dell'espressione, le sue funzionalità è descritto sopra. La citometria a flusso e FACS è la tecnica alternativa di studio dell'espressione. Ha un minimo ad alta capacità di lavorazione (fino a 384 lastre grosse buone). Può essere usata per le celle fisse o in tensione e può determinare le proprietà chimiche e fisiche come la dimensione, l'espressione degli indicatori di superficie e più. Può essere usata per quantificare ed ordinare le celle (FACS). Per concludere, è un metodo quantitativo.

Domande di studio dell'identificazione

ELISPOT può essere usato quando studia l'identificazione. Ha un media a capacità di lavorazione alta (una lastra grossa di 96 pozzi) e può essere usato sulle celle in tensione. Può identificare le celle specifiche che secernono un analito di interesse ed ha un'alta sensibilità. Può essere sia quantitativo che qualitativo.

Selezionare l'anticorpo primario

Nel selezionare l'anticorpo primario, il tipo corretto, monoclonale o policlonale, deve essere considerato.

Gli anticorpi monoclonali riconoscono soltanto un singolo epitopo sull'antigene, essi generano meno rumore di fondo poichè sono meno probabili inter-reagire con altre proteine. Inoltre, la loro omogeneità è molto alta, significando che la variabilità fra i batch è bassa.

Sono egualmente estremamente efficienti all'associazione con l'antigene all'interno di una miscela delle molecole relative. Tuttavia, non funzionano in una gamma completa di specie dovuto loro che sono troppo specifiche. Egualmente sono vulnerabili a perdita di epitopo con il trattamento chimico dell'antigene.

D'altra parte, le funzionalità degli anticorpi policlonali sono come segue: Riconoscono gli epitopi multipli su tutto l'un antigene, hanno un'alta affinità e possono contribuire ad ampliare il segnale dalle proteine basse di espressione, sono più tolleranti ai cambiamenti secondari all'antigene e possono essere usate per individuare le proteine dalle specie all'infuori di quello dell'immunizzazione. Tuttavia, gli svantaggi sono che sono alla la variabilità incline di batch--batch e possono produrre un segnale di sfondo.

Selezionare l'anticorpo secondario

Il tipo di metodo che è usando informerà quale anticorpo secondario è adatto. Sotto descriviamo quei tipi che sono utilizzabili per la tecnica.

- IHC: HRP o AP-coniugato, frammento, biotinylated (avidina/streptavidin coniugato all'enzima o al fluorocromo), fluorocromi quali le tinture di Alexa Fluor®, di Cy®, FITC e PE e pre-adsorbito.

- ICC: Anticorpi del frammento, biotinylated (avidina/streptavidin coniugato al fluorocromo), fluorocromi quali le tinture di Alexa Fluor®, di Cy®, FITC e PE e pre-adsorbiti.

- Macchia occidentale: HRP o AP-coniugato, biotinylated (avidina/streptavidin coniugato all'enzima), fluorocromi quale Alexa Flour® (Alexa 680 e Alexa 790), anticorpi specifici VeriBlot della catena leggera per il IP.

- ELISA e ELISPOT: HRP o AP-coniugato, biotinylated (avidina/streptavidin coniugato all'enzima), monoclonale (particolarmente anticorpi sottotipo-specifici quale anti-IgG1)

- Citometria a flusso e FACS: Fluorocromi quali le tinture di Alexa Fluor®, di Cy®, FITC e PE, biotinylated (avidina/streptavidin coniugato al fluorocromo), il frammento 2 di F e monoclonale (ab') e gli anticorpi primari coniugati per l'elevazione del risparmio di temi di tempo.

Sorgenti:

Dowd, S., Halonen, M. e Maier, R. (2009). Metodi immunologici. Microbiologia ambientale, pp.225-241. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123705198000122

Murata, L., Brunhoeber, P., Clements, J., ElGabry, E., Feng, J., Kapadia, M., Mistry, A., Singh, S. e passeggiata, E. (2019). Immunohistochemistry. Tambuccio e sistemi diagnostici complementari, pp.53-91. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780128135396000043

Pillot, J. (1996). L'anno di Pasteur: dal concetto dell'anticorpo e dell'antigene da Bordet (1895) al ELISA. Che futuro per la diagnosi immunologica?. Virologia clinica e diagnostica, 5 (2-3), pp.191-196. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0928019796002218

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Last Updated: Mar 10, 2020

Sarah Moore

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Sarah Moore

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