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Como escolher um específico do anticorpo à aplicação

Que são anticorpos e como eles são usados na pesquisa?

Os anticorpos são proteínas manufacturados pelas pilhas de B dentro dos sistemas imunitários de formulários de vida mais alta como uma característica adaptável para permitir que o corpo enderece as moléculas estrangeiras de invasão que levantam uma ameaça ao organismo. A função natural dos anticorpos envolve seu acessório aos antígenos (que pertencem aos corpos estrangeiros de invasão), para embandeirá-los para a destruição pelo sistema imunitário.

anticorposCréditos de imagem: Design_Cells/Shutterstock.com

Esta propensão inata anexar-se às moléculas específicas estabeleceu seu uso na investigação científica. Porque os anticorpos específicos podem ser escolhidos que são sabidos para travar em determinados antígenos, os pesquisadores podem usar anticorpos para identificar a presença de determinadas substâncias. Conseqüentemente, o uso dos anticorpos tornou-se confiado pesadamente no estudo da função da proteína nas pilhas.

As técnicas numerosas foram desenvolvidas que exploram a natureza dos anticorpos a fim investigar proteínas nas pilhas e nos tecidos. As aplicações tais como a mancha do immunohistochemistry, os immunocytochemistry, os ocidentais, ELISA, o cytometry de fluxo e FACS, e ELISPOT, são todas os métodos estabelecidos que utilizam anticorpos.

A fim fazer o a maioria destas técnicas investigatórios poderosas, é essencial que o anticorpo correcto está escolhido que sere a aplicação específica. Abaixo dos nós discutimos como escolher o anticorpo correcto para sua aplicação.

Escolhendo a aplicação direita

A primeira etapa de escolher o anticorpo direito para sua experiência é assegurar-se de que você seleccione a aplicação correcta que é a mais apropriada para suas finalidades da pesquisa. Abaixo, nós esboçamos as características principais dos vários métodos:

Pedidos para estudar a localização

O Immunohistochemistry tem um ponto baixo à produção média, pode ser usado para pilhas e tecidos fixos, pode produzir a localização celular, tem uma definição espacial alta, focaliza-a tipicamente em uma única proteína, pode-a proteínas múltiplas da imagem imediatamente, e é-a qualitativo e semiquantitativo.

A outra técnica que estuda a localização é immunocytochemistry. Esta técnica tem um ponto baixo à produção alta, pode ser usada para pilhas e tecidos fixos, pode produzir a localização subcelular, pode proteínas múltiplas da imagem imediatamente, e é qualitativa e semiquantitativa. Contudo, sua definição espacial é limitada pela estrutura do tecido.

Pedidos para estudar a concentração

A mancha ocidental é a técnica apropriada para estudar a concentração da proteína. Tem um ponto baixo à produção média, pode ser usada para lysates da pilha e do tecido, gera níveis relativos da proteína, pode estabelecer o peso molecular, os isoforms e alterações cargo-translational, e é semiquantitativa.

Pedidos para estudar a interacção

ELISA é a técnica apropriada para estudar interacções da proteína. O método tem um media à produção alta (placa de 96 poços), ele pode ser usado para estudar o soro/plasma, vivo ou pilhas e tecido fixos, produz níveis exactos da proteína, é quantitativo e qualitativo.

Pedidos para estudar a expressão

ELISA pode igualmente ser usado estudando a expressão, suas características é esboçado acima. O cytometry de fluxo e FACS são a técnica alternativa de estudar a expressão. Tem um ponto baixo à produção alta (até 384 placas boas). Pode ser usada para pilhas fixas ou vivas e pode determinar propriedades químicas e físicas tais como o tamanho, a expressão dos marcadores de superfície, e o mais. Pode ser usada para determinar e classificar as pilhas (FACS). Finalmente, é um método quantitativo.

Pedidos para estudar a identificação

ELISPOT pode ser usado ao estudar a identificação. Tem um media à produção alta (placa de 96 poços) e pode ser usado em pilhas vivas. Pode identificar as pilhas específicas que segregam um analyte do interesse e tem uma sensibilidade alta. Pode ser quantitativo e qualitativo.

Selecionando o anticorpo preliminar

Ao selecionar o anticorpo preliminar, o tipo correcto, monoclonal ou polyclonal, deve ser considerado.

Os anticorpos monoclonais reconhecem somente um único resumo no antígeno, eles geram menos ruído de fundo porque são menos prováveis cruz-reagir com outras proteínas. Também, sua homogeneidade é muito alta, significando que a variabilidade entre grupos é baixa.

São igualmente extremamente eficientes na ligação com o antígeno dentro de uma mistura de moléculas relacionadas. Contudo, não trabalham em uma série completa da espécie devido a ela que é demasiado específica. Igualmente são vulneráveis à perda do resumo com o tratamento químico do antígeno.

Por outro lado, as características de anticorpos polyclonal são como segue: Reconhecem resumos múltiplos em todo o um antígeno, têm uma afinidade alta e podem ajudar a amplificar o sinal das baixas proteínas da expressão, são mais tolerantes às mudanças menores ao antígeno, e podem ser usados para detectar proteínas das espécies diferentes daquele da imunogenicidade. Contudo, as desvantagens são que são variabilidade inclinada do grupo-à-grupo e podem produzir um sinal de fundo.

Selecionando o anticorpo secundário

O tipo de método que está sendo usado informará que anticorpo secundário é apropriado. Abaixo dos nós esboçamos aqueles tipos que são úteis para a técnica.

- IHC: HRP ou AP-conjugado, fragmento, biotinylated (avidin/streptavidin conjugado à enzima ou ao fluorochrome), fluorochromes tais como tinturas de Alexa Fluor®, de Cy®, FITC, e PE, e pre-fixado.

- ICC: Anticorpos do fragmento, biotinylated (avidin/streptavidin conjugado ao fluorochrome), fluorochromes tais como tinturas de Alexa Fluor®, de Cy®, FITC, e PE, e pre-fixados.

- Mancha ocidental: HRP ou AP-conjugado, biotinylated (avidin/streptavidin conjugado à enzima), fluorochromes tais como Alexa Flour® (Alexa 680 e Alexa 790), anticorpos específicos VeriBlot da corrente clara para o IP.

- ELISA e ELISPOT: HRP ou AP-conjugado, biotinylated (avidin/streptavidin conjugado à enzima), monoclonal (anticorpos especialmente subtipo-específicos tais como anti-IgG1)

- Cytometry de fluxo e FACS: Fluorochromes tais como tinturas de Alexa Fluor®, de Cy®, FITC, e PE, biotinylated (avidin/streptavidin conjugado ao fluorochrome), fragmento 2 monoclonal, de F (ab'), e anticorpos preliminares conjugados para maximizar a eficiência do tempo.

Fontes:

Dowd, S., Halonen, M. e Maier, R. (2009). Métodos imunológicos. Microbiologia ambiental, pp.225-241. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123705198000122

Murata, L., Brunhoeber, P., Clements, J., ElGabry, E., Feng, J., Kapadia, M., Mistry, A., Singh, S. e caminhada, E. (2019). Immunohistochemistry. Companheiro e diagnósticos complementares, pp.53-91. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780128135396000043

Pillot, J. (1996). O ano de Pasteur: do conceito do anticorpo e do antígeno por Bordet (1895) ao ELISA. Que futuro para o diagnóstico imunológico?. Virologia clínica e diagnóstica, 5 (2-3), pp.191-196. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0928019796002218

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Last Updated: Mar 10, 2020

Sarah Moore

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Sarah Moore

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