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Come leggere i cromatogrammi di LC-MS

Cromatografia a fase mobile liquida - la spettrometria di massa (LC-MS) combina due approcci per separare ed identificare le molecole o i composti presenti in un campione. La cromatografia liquida a alta pressione (HPLC) separa le componenti di una miscela, mentre la spettrometria di massa (MS) offre gli strumenti di rilevazione per identificarle. LC-MS, come metodo per la comprensione delle molecole biologiche, ha applicazioni sia nella ricerca che nella diagnosi clinica.

Tuttavia, l'interpretazione dei cromatogrammi generati con questo metodo richiede una comprensione fondamentale di come LC-MS funziona.

Cromatogramma che ordina sulla diapositiva. Credito di immagine: foto/Shutterstock di scienza
Cromatogramma che ordina sulla diapositiva. Credito di immagine: foto/Shutterstock di scienza

Metodo di LC-MS

Prima che il HPLC sia essere usando iniziato ampiamente ed ancora oggi, la gascromatografia (GC) è impiegata spesso. L'idea di coppia della tecnica per la separazione delle componenti di una miscela, quali HPLC o GASCROMATOGRAFIA, con il ms per analizzare quelle componenti è entrato durante gli anni 50.

La GASCROMATOGRAFIA ed il ms si sono combinati come GC-MS, una tecnica che ancora si applica comunemente nella biologia clinica per schermare le miscele complesse per l'identificazione delle sostanze conosciute, per esempio, provare a droghe in urina. LC-MS è stato sviluppato più successivamente, durante gli anni 80. Il ritardo nella combinazione dei due approcci era dovuto le difficoltà iniziali con la sorgente di ione del ms ed il flusso liquido del HPLC. La soluzione a questi problema ed attuabilità successiva di LC-MS utile a John Fenn il premio Nobel.

LC-MS comincia con il HPLC, in cui un liquido è passato attraverso una colonna. In questa colonna, le componenti sono separate hanno basato sulle interazioni idrofobe, sullo scambio ionico, o su altre caratteristiche variabili. Il HPLC da solo non può essere usato per l'identificazione, perché le molecole differenti possono dividere i cosiddetti tempi di conservazione.

Il tempo di conservazione è il momento speso affinchè un soluto passi attraverso la colonna. Questi beni possono essere divisi fra parecchie componenti di una miscela, che è perché i metodi del ms sono applicati. Il cromatogramma reso dal questo manifestazioni il tempo di conservazione dall'intensità (quantità di presente della componente).

Una volta che separate, le componenti sono convertite in stato ionizzato. Il ms usa la massa al rapporto di tassa come fattore di caratterizzazione per identificare le componenti, in modo dal punto seguente comprende la separazione di componenti basate su questa.

La massa al rapporto di tassa è più specifica ad una molecola particolare che il tempo di conservazione nel HPLC, ecco perché ms è impiegato. Gli analizzatori della massa per fare pagare le differenze, appena come la tecnica di separazione nel HPLC, possono differire, compreso gli analizzatori quali il quadruplo, il tempo di volo e la trappola dello ione.

Gli ioni emergenti poi sono contati da un rivelatore. Lo spettro risultante del ms mostra la massa al rapporto di tassa tracciato contro l'intensità di punta.

Interpretazione dei cromatogrammi

I cromatogrammi mostrano le componenti poichè le funzioni del loro tempo e massa di conservazione al rapporto di tassa dall'abbondanza relativa di massa, significanti l'output totale da un LC-MS pieno è un grafico con due asce orizzontali. Il fuoco del grafico può essere alterato secondo lo scopo del ricercatore.

Il cromatogramma non cambia per un analito, quindi può essere usato spesso come impronta digitale per i tipi di molecole.

Ciò è fatta tipicamente mediante l'esame dove i picchi del tempo e della massa di conservazione al rapporto di tassa sono. Al giorno d'oggi, la maggior parte delle analisi dei cromatogrammi sono fatte informaticamente. Ciò significa che un software confronterà i cromatogrammi generati a quei conosciuti per identificare le componenti, o lo memorizza come recentemente scoperta.

Ci sono parecchi modi assicurare la lettura adeguata dei cromatogrammi. È dato che i fattori quali le caratteristiche che causano la separazione nel LC, nei metodi di ionizzazione e negli analizzatori di massa al rapporto di tassa possono tutti variare, sviluppandosi una risposta globale a trattamento accurato dei cromatogrammi duro. Quando le impostazioni di LC-MS si applicano per coprire una vasta gamma di composti, un metodo chiamato delineamento differenziale, i punti per elaborare si muoverà attraverso le fasi.

La filtrazione spettrale punta su eliminare il disturbo nei dati, quindi facilitanti la rilevazione dei picchi di interesse. La riduzione di disturbo può anche essere ottimizzata durante il LC-MS usando le più brevi colonne con le più piccole dimensioni delle particelle, tra altri metodi.

La rilevazione di punta segue la filtrazione, con cui i picchi rappresentano le componenti o le fratture delle componenti. I picchi possono essere selezionati in base ad altezza o a settore che trattano. Determinati reticoli di punta possono essere identificati dall'occhio, corrispondendo sui picchi presenti a quei conosciuti. Ciò può contribuire a determinare che molecole sono presenti, o quante atomi sono presenti nella molecola.

Sorgenti

  1. http://www.ecs.umass.edu/eve/background/methods/chemical/Openlit/Chromacademy%20LCMS%20Intro.pdf
  2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16026613
  3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2643089/
  4. http://www.rsc.org/images/AMC%20LCMS%20Guide_tcm18-240030.pdf

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Last Updated: Sep 19, 2018

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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