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Como ler cromatogramas de LC-MS

Cromatografia líquida - a espectrometria em massa (LC-MS) combina duas aproximações para separar e identificar as moléculas ou os compostos actuais em uma amostra. A cromatografia líquida do elevado desempenho (HPLC) separa componentes de uma mistura, visto que a espectrometria em massa (MS) oferece as ferramentas da detecção as identificar. LC-MS, como um método para compreender moléculas biológicas, tem aplicações na pesquisa e no diagnóstico clínico.

Contudo, a interpretação dos cromatogramas gerados através deste método exige uma compreensão fundamental de como LC-MS trabalha.

Cromatograma que arranja em seqüência na corrediça. Crédito de imagem: foto/Shutterstock da ciência
Cromatograma que arranja em seqüência na corrediça. Crédito de imagem: foto/Shutterstock da ciência

Método de LC-MS

Antes que a HPLC estêve utilização começada extensamente, e ainda hoje, a cromatografia de gás (GC) foi empregada frequentemente. A ideia de acoplar uma técnica para separar componentes de uma mistura, tais como a HPLC ou o GC, com MS para analisar aqueles componentes veio dentro durante os anos 50.

O GC e o MS foram combinados como GC-MS, uma técnica que fosse aplicada ainda geralmente na biologia clínica para seleccionar as misturas complexas para a identificação de substâncias conhecidas, por exemplo, testar para drogas na urina. LC-MS foi desenvolvido mais tarde, durante os anos 80. A retardação em combinar as duas aproximações era devido às dificuldades iniciais com a fonte de íon do MS e ao córrego líquido da HPLC. A solução a estes problema e viabilidade subseqüente de LC-MS ganhou a John Fenn o prémio nobel.

LC-MS começa com a HPLC, onde um líquido é passado através de uma coluna. Nesta coluna, os componentes são separados basearam em interacções hidrofóbicas, em troca iónica, ou em outras características variáveis. A HPLC apenas não pode ser usada para a identificação, porque as moléculas diferentes podem compartilhar de tempos de retenção assim chamados.

O tempo de retenção é o momento tomado para que um solute passe através da coluna. Esta propriedade pode ser compartilhada entre diversos componentes de uma mistura, que é porque os métodos do MS são aplicados. O cromatograma rendido do este mostras o tempo de retenção pela intensidade (uma quantidade de presente do componente).

Uma vez que separados, os componentes são convertidos a um estado ionizado. O MS usa a massa à relação de carga como um factor de caracterização para identificar componentes, assim que o passo seguinte envolve a separação de componentes baseados neste.

A massa à relação de carga é mais específica a uma molécula particular do que o tempo de retenção na HPLC, MS é empregado é por isso. Os analisadores da massa para cobrar diferenças, apenas como a técnica de separação na HPLC, podem diferir, incluindo analisadores tais como o quadrupole, época de vôo, e armadilha do íon.

Os íons emergentes são contados então por um detector. O espectro resultante do MS mostra a massa à relação de carga traçada contra a intensidade máxima.

Interpretando os cromatogramas

Os cromatogramas mostram componentes porque as funções de seus tempo e massa de retenção à relação de carga pela abundância relativa em massa, significando a saída total de um LC-MS completo são um gráfico com os dois machados horizontais. O foco do gráfico pode ser alterado segundo o objetivo do pesquisador.

O cromatograma não muda para um analyte, conseqüentemente pode frequentemente ser usado como uma impressão digital para tipos de moléculas.

Isto é feito tipicamente olhando onde os picos do tempo e da massa de retenção à relação de carga estão. Hoje em dia, a maioria de análises dos cromatogramas são feitas computacionalmente. Isto significa que um software comparará cromatogramas gerados aos conhecido a fim identificar os componentes, ou armazena-o como recentemente descoberto.

Há diversas maneiras de assegurar a leitura apropriada dos cromatogramas. É dado que todos os factores tais como as características que causam a separação no LC, nos métodos da ionização, e nos analisadores da massa à relação de carga podem variar, se tornando uma resposta global ao processamento exacto dos cromatogramas duro. Quando os ajustes de LC-MS são aplicados para cobrir uma escala larga dos compostos, um método chamado perfilamento diferencial, as etapas para processar mover-se-á através das fases.

A filtração espectral visa remover o ruído nos dados, facilitando desse modo a detecção de picos do interesse. A redução de ruído pode igualmente ser aperfeiçoada durante LC-MS usando umas colunas mais curtos com dimensão das partículas menores, entre outros métodos.

A detecção máxima segue a filtração, por meio de que os picos representam componentes ou fracturas dos componentes. Os picos podem ser seleccionados com base na altura ou na área que cobrem. Determinados testes padrões máximos podem ser identificados pelo olho, combinando acima dos picos actuais aos conhecidos. Isto pode ajudar a determinar que moléculas estam presente, ou quantas átomos estam presente na molécula.

Fontes

  1. http://www.ecs.umass.edu/eve/background/methods/chemical/Openlit/Chromacademy%20LCMS%20Intro.pdf
  2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16026613
  3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2643089/
  4. http://www.rsc.org/images/AMC%20LCMS%20Guide_tcm18-240030.pdf

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Last Updated: Sep 19, 2018

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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