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Authentification humaine de lignée cellulaire par le STREPTOCOQUE profilage

Récent, il y a eu une augmentation de l'utilisation des lignées cellulaires humaines pour des recherches. Cependant, ceci a été également accompagné d'une augmentation de la contamination croisée. Le profilage court de la séquence répétée en tandem (STR) ADN est une solution qui a été proposée pour le dépistage de la contamination transversale et l'authentification des lignées cellulaires humaines.

Le profilage court de la séquence répétée en tandem ADN est une solution qui a été proposée pour le dépistage de la contamination transversale dans les lignées cellulaires humaines.Design_Cells | Shutterstock

Combien de fois la contamination transversale se produit-elle ?

La contamination transversale est un problème critique dans la culture cellulaire, avec des études proposant que jusqu'à 16-35% de toutes les expériences soient affecté. Ceci influence la recherche car les résultats enregistrés peuvent exactement ne pas réfléchir les caractéristiques vraies et reproduire l'expérience est difficile. Trouver les lignées cellulaires contaminées est pour cette raison impératif.

Trouver la croix-contaminaton est particulièrement difficile pour des cellules avec les morphologies ou les phénotypes assimilés. Par exemple, la lignée cellulaire hela, qui a été développée en 1951, se compose maintenant de plus de 90 lignées cellulaires. Dans une étude récente, des lignées cellulaires différentes du sein, thyroïde, végétation adénoïde, cancers tous d'oesophage se sont avérées croix-contaminées. Ainsi, l'utilisation des méthodes qui peuvent recenser des lignées cellulaires est devenue essentielle.

Que la séquence répétée en tandem courte (STR) profile-t-elle ?

Les séquences répétées en tandem courtes se rapportent aux courtes séquences d'ADN qui sont identiques entre les cellules des mêmes lignées cellulaires, et se situent successivement dans des régions spécifiques des chromosomes. La taille des séquences répétées en tandem courtes peut s'échelonner de deux à treize nucléotides, et elles sont employées pour comparer des lieux spécifiques sur l'ADN dans différents échantillons.

En 1985, Alec Jeffreys et ses collègues ont montré la présence des séquences répétées en tandem de nombre variable distribuées dans tout le génome qui peut provoquer une signature caractéristique d'ADN. Ceci peut être employé pour recenser les lignées cellulaires particulières. Cependant, il peut être difficiles interpréter ces empreintes digital. Comme solution, des séquences répétées en tandem de court-circuit (STR) ont été employées. Le STREPTOCOQUE se compose des courtes séquences de taille 1-6 paires de bases.

STREPTOCOQUE profilage des lignées cellulaires humaines : Méthodologie

Le profilage court de séquence répétée en tandem peut être effectué dans n'importe quel laboratoire qui a la capacité pour des techniques de biologie moléculaire. Dès qu'une lignée cellulaire sera reçue dans un laboratoire, toute l'information concernant son nom, le nom du donneur, le nom de la lignée cellulaire originelle, le tissu d'origine, la période de doublement, ses caractéristiques et les fonctionnements sont enregistrés.

Pour le développement de l'analyse pour les cellules adhérentes, le milieu de culture est d'abord retiré et jeté. La surface est alors rincée utilisant PBS (qui est par la suite jeté) et les cellules sont dissociées. Ceci est suivi du lavage de la boulette et du resuspension dans PBS avant de compter les cellules.

Conditions de stockage

Les cellules sont repérées dans une carte de FTA en suspendant 200.000 cellules dans PBS. Alors un disque de 1,2 millimètres est poinçonné dans le centre de l'endroit témoin et un plongeur est utilisé pour éjecter le disque dans la plaque de puits de réaction.

Le procédé d'amplification concerne ajouter toutes les composantes d'un mélange d'ACP dans un tube stérile et vortexing pendant 10 secondes. Alors le μl 25 du mélange d'ACP est ajouté au tube de réaction qui contient le disque de FTA. La mise en chauffage concerne mettre la plaque dans le cycle et le fonctionnement thermiques le protocole recommandé. Les échantillons amplifiés peuvent être enregistrés à 4°C après avoir complété ce cycle.

Dépistage

Les amorces étiquetées avec les bornes fluorescentes identifient différents lieux dans la réaction d'ACP. Après que l'ACP soit complété, les normes internes pour la taille peuvent être ajoutées au mélange de la réaction et l'ADN peut être séparé sur la base de la taille utilisant l'électrophorèse en gel capillaire.

L'analyse granulométrique est complétée utilisant le logiciel de GeneMapper ID-X, qui compare la taille de différents fragments d'ADN aux normes internes. Le génotypage court de séquence répétée en tandem est fait par la conversion des tailles d'amplicon dans des allèles utilisant l'échelle allélique.

Analyse d'authentification et de caractéristiques

Si le STREPTOCOQUE profil montre plus qu'une correspondance de 80%, une lignée cellulaire est considérée authentique, alors qu'une correspondance qui est moins de 56% est considérée indépendante. Dans certains cas, cependant, le profil de correspondance peut être indéterminé si la similitude est entre 56% et 80%. Habituellement, au moins huit le STREPTOCOQUE lieux sont exigés pour déterminer l'identité d'une lignée cellulaire humaine.

Sources

Further Reading

Last Updated: May 2, 2019

Dr. Surat P

Written by

Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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