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Autenticazione umana della linea cellulare dallo STREPTOCOCCO profilare

Recentemente, c'è stato un aumento nell'uso delle linee cellulari umane per la ricerca. Tuttavia, questo egualmente è stato accompagnato da un aumento nella contaminazione trasversale. Il breve delineamento del DNA (STR) di ripetizione in tandem è una soluzione che è stata proposta per la rilevazione di contaminazione trasversale e l'autenticazione delle linee cellulari umane.

Il breve delineamento del DNA di ripetizione in tandem è una soluzione che è stata proposta per la rilevazione di contaminazione trasversale nelle linee cellulari umane.Design_Cells | Shutterstock

Ogni quanto tempo la contaminazione trasversale accade?

La contaminazione trasversale è una questione critica nella coltura cellulare, con gli studi che suggeriscono che fino a 16-35% di tutti gli esperimenti sia commovente. Ciò urta la ricerca poichè i risultati registrati non possono riflettere esattamente i dati veri e ripiegare l'esperimento è difficile. La rilevazione delle linee cellulari contaminate è quindi di importanza fondamentale.

La rilevazione inter--contaminaton è particolarmente difficile per le celle con le simili morfologie o fenotipi. Per esempio, la linea cellulare HeLa, che è stata sviluppata nel 1951, ora consiste di più di 90 linee cellulari. In uno studio recente, le linee cellulari diverse dal petto, la tiroide, l'adenoide, i cancri tutti dell'esofago sono state trovate inter-per essere contaminate. Quindi, l'uso dei metodi che possono identificare le linee cellulari è diventato cruciale.

Che cosa la breve ripetizione in tandem (STR) sta profilando?

Le brevi ripetizioni in tandem si riferiscono alle brevi sequenze del DNA che sono identiche fra le celle dalle stesse linee cellulari e si trovano successivamente nelle regioni specifiche dei cromosomi. La dimensione di brevi ripetizioni in tandem può variare da due a tredici nucleotidi e sono usate per confrontare i luoghi specifici su DNA in campioni differenti.

Nel 1985, Alec Jeffreys ed i suoi colleghi hanno mostrato la presenza di ripetizioni in tandem di numero variabile distribuite in tutto il genoma che può provocare un'impronta caratteristica di DNA. Ciò può essere usata per identificare le linee cellulari particolari. Tuttavia, queste impronte digitali possono essere difficili da interpretare. Come soluzione, le ripetizioni in tandem di short (STR) sono state usate. Lo STREPTOCOCCO consiste di brevi sequenze della dimensione 1-6 coppie di basi.

STREPTOCOCCO delineamento delle linee cellulari umane: Metodologia

Il breve delineamento di ripetizione in tandem può essere effettuato in tutto il laboratorio che ha la capacità per le tecniche di biologia molecolare. Non appena una linea cellulare è ricevuta in un laboratorio, tutte le informazioni per quanto riguarda il suo nome, il nome del donatore, il nome della linea cellulare originale, il tessuto dell'origine, il periodo di raddoppiamento, le sue caratteristiche e le funzioni sono registrati.

Per lo sviluppo dell'analisi per le celle aderenti, il terreno di coltura in primo luogo è eliminato ed eliminato. La superficie poi è risciacquata facendo uso di PBS (che successivamente è eliminato) e le celle sono dissociate. Ciò è seguita dal lavare della pallina e del resuspension in PBS prima del conteggio delle celle.

Condizioni di stoccaggio

Le celle sono macchiate in una scheda di FTA sospendendo 200.000 celle in PBS. Poi un disco da 1,2 millimetri è perforato nel centro del punto del campione e uno stantuffo tuffante è utilizzato per espellere il disco nella lastra grossa del pozzo della reazione.

Il trattamento di amplificazione comprende aggiungere tutte le componenti di una miscela di PCR in un tubo sterile e vortexing per 10 secondi. Poi il μl 25 della miscela di PCR si aggiunge al tubo della reazione che contiene il disco di FTA. Il riciclaggio termico comprende collocare la lastra grossa nel ciclo e nel funzionamento termici il protocollo raccomandato. I campioni ampliati possono essere memorizzati a 4°C dopo il completamento del questo ciclo.

Rilevazione

Le mani di fondo etichettate con gli indicatori fluorescenti riconoscono i luoghi differenti nella reazione di PCR. Dopo che la PCR è completata, gli standard interni per la dimensione possono aggiungersi alla miscela di reazione ed il DNA può essere separato in base alla dimensione facendo uso dell'elettroforesi capillare del gel.

L'analisi granulometrica è completata facendo uso del software di GeneMapper ID-X, che paragona la dimensione delle sequenze di DNA differenti agli standard interni. La breve ripetizione in tandem che genotyping è fatta dalla conversione delle dimensioni del amplicon negli alleli facendo uso della scala allelic.

Analisi di dati e di autenticazione

Se lo STREPTOCOCCO profilo mostra più di una corrispondenza di 80%, una linea cellulare è considerata autentica, mentre una corrispondenza che è meno di 56% è considerata come indipendente. In alcuni casi, tuttavia, il profilo della corrispondenza può essere indeterminato se la similarità è fra 56% e 80%. Solitamente, almeno otto lo STREPTOCOCCO luoghi è richiesto di stabilire l'identità di una linea cellulare umana.

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Last Updated: May 2, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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