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Autenticação humana da linha celular pelo ESTREPTOCOCO perfilamento

Recentemente, houve um aumento no uso de linha celular humanas para fins de investigação. Contudo, isto foi acompanhado igualmente de um aumento na contaminação transversal. O perfilamento curto do ADN (STR) da repetição em tandem é uma solução que foi propor para a detecção de contaminação colateral e a autenticação de linha celular humanas.

O perfilamento curto do ADN da repetição em tandem é uma solução que foi propor para a detecção de contaminação colateral em linha celular humanas.Design_Cells | Shutterstock

Como frequentemente a contaminação colateral ocorre?

A contaminação colateral é um assunto crítico na cultura celular, com os estudos que sugerem que até 16-35% de todas as experiências sejam afetadas. Isto impacta a pesquisa porque os resultados gravados não podem exactamente reflectir os dados verdadeiros e replicating a experiência é difícil. Detectar linha celular contaminadas é conseqüentemente imperativo.

Detectar a cruz-contaminaton é particularmente difícil para pilhas com morfologias ou fenótipos similares. Por exemplo, a linha celular HeLa, que foi desenvolvida em 1951, consiste agora em mais de 90 linha celular. Em um estudo recente, as linha celular diferentes do peito, tiróide, adenóide, cancros todos do esófago foram encontradas cruz-para ser contaminadas. Assim, o uso dos métodos que podem identificar linha celular tornou-se crucial.

Que a repetição em tandem curto (STR) está perfilando?

As repetições em tandem curtos referem as seqüências curtos do ADN que são idênticas entre pilhas das mesmas linha celular, e encontram-se sucessivamente em regiões específicas dos cromossomas. O tamanho de repetições em tandem curtos pode variar de dois a treze nucleotides, e são usados para comparar locus específicos no ADN em amostras diferentes.

Em 1985, Alec Jeffreys e seus colegas mostraram a presença de repetições em tandem do número variável distribuídas durante todo o genoma que pode causar uma assinatura característica do ADN. Isto pode ser usado para identificar linha celular particulares. Contudo, estas impressões digitais podem ser difíceis de interpretar. Como uma solução, as repetições em tandem curtos (STR) foram usadas. O ESTREPTOCOCO consiste em seqüências curtos de pares baixos do tamanho 1-6.

ESTREPTOCOCO perfilamento de linha celular humanas: Metodologia

O perfilamento curto da repetição em tandem pode ser realizado em todo o laboratório que tiver a capacidade para técnicas da biologia molecular. Assim que uma linha celular for recebida em um laboratório, toda a informação em relação a seu nome, o nome do doador, o nome da linha celular original, o tecido da origem, o período de duplicação, suas características e as funções estão gravados.

Para a revelação do ensaio para pilhas aderentes, o media de cultura primeiramente é removido e rejeitado. A superfície é enxaguada então usando PBS (que é rejeitado subseqüentemente) e as pilhas são separadas. Isto é seguido lavando da pelota e do resuspension em PBS antes de contar as pilhas.

Condições de armazenamento

As pilhas são manchadas em um cartão do FTA suspendendo 200.000 pilhas em PBS. Um disco de 1,2 milímetros é perfurado então no centro do ponto da amostra e um actuador é usado para ejectar o disco na placa do poço da reacção.

O processo da amplificação envolve adicionar todos os componentes de uma mistura do PCR em uma câmara de ar estéril e vortexing por 10 segundos. O μl 25 da mistura do PCR é adicionado então à câmara de ar da reacção que contem o disco do FTA. O ciclismo térmico envolve colocar a placa no ciclo e no corredor térmicos o protocolo recomendado. As amostras amplificadas podem ser armazenadas em 4°C após ter terminado este ciclo.

Detecção

As primeiras demão etiquetadas com os marcadores fluorescentes reconhecem locus diferentes na reacção do PCR. Depois que o PCR é terminado, os padrões internos para o tamanho podem ser adicionados à mistura de reacção e o ADN pode ser separado com base no tamanho usando a electroforese capilar do gel.

A análise de tamanho é terminada usando o software de GeneMapper ID-X, que compara o tamanho de fragmentos diferentes do ADN com os padrões internos. A repetição em tandem curto que genotyping é feita pela conversão dos tamanhos do amplicon em alelos usando a escada allelic.

Análise da autenticação e de dados

Se o ESTREPTOCOCO perfil mostra mais do que um fósforo de 80%, uma linha celular está considerada autêntica, quando um fósforo que seja menos de 56% for considerado ser não relacionado. Em alguns casos, contudo, o perfil do fósforo pode ser indeterminado se a similaridade está entre 56% e 80%. Geralmente, pelo menos oito o ESTREPTOCOCO locus é exigido estabelecer a identidade de uma linha celular humana.

Fontes

Further Reading

Last Updated: May 2, 2019

Dr. Surat P

Written by

Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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